黄病毒属非结构蛋白5的研究进展

非结构蛋白5(NS5)作为黄病毒属中最保守的非结构蛋白,具有甲基转移酶活性和RNA依赖的RNA聚合酶活性,在病毒RNA复制过程中发挥着至关重要的作用。深入研究发现不同种黄病毒的NS5蛋白还能与宿主细胞的功能蛋白相互作用,通过不同的作用机制介导病毒的免疫逃逸。该文概述了NS5蛋白的结构、亚细胞定位及其功能,并阐述NS5蛋白在病毒复制及介导病毒免疫逃逸领域的机制研究以及靶向NS5蛋白的小分子抑制剂的研究进展。     

登革4型病毒基因组cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用

目的:探讨登革4型病毒C基因中保守的cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用.方法:首先在获得含有海肾荧光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建cHP发卡结构系列突变体(cHP1～cHP6).将构建的突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞.通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R.luc报告基因检测技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译进行检测.结果:cHP发卡结构系列突变体均可在BHK-21细胞中复制并稳定表达病毒特异蛋白,在该发卡结构中引入缺失或突变对病毒早期翻译并无显著影响,但病毒RNA复制均显著下调.结论:cHP发卡结构在基因组RNA复制过程中可能具有重要的调控作用.     

含有海肾萤光素酶报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子的构建

目的:构建含有海肾萤光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子,为探讨病毒基因组中保守序列和元件在复制和翻译调控机制中的作用提供新的手段.方法:利用定点诱变PCR技术构建prM-E基因缺失的登革4型病毒亚基因组复制子(DENRP),用顺式水解酶元件(cis-acting hydrolase element,CHYSEL)技术将R.luc报告基因插入到DENRP缺失的结构基因区,构建含有R.luc报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP).将构建的复制子线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光、RT-PCR和R.luc检测技术对复制子进行鉴定.结果:所构建的prM-E基因缺失的复制子和含有海肾萤光素酶报告基因的复制子,均可在BHK-21细胞中自主复制并稳定表达病毒特异蛋白.DEN-R.luc2A-RP可持续表达外源R.luc报告基因21 d,在转染后24~96 h R.luc荧光信号呈线性增强.在该区间进行实时检测可显示复制子复制和翻译水平的变化.结论:获得了两株可在BHK-21细胞中稳定表达的复制子,为进一步研究登革4型病毒复制和翻译机制奠定了基础.     

登革4型病毒5''非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA)。然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R·luc)报告基因的复制子(DEN-R·luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R·luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3.2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点：SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构（M77G/C）;SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构（M77-78AG/GA）。然后在含有海肾荧光素酶（Renilla Luciferase,R·luc）报告基因的复制子（DEN-R·luc2A-RP）基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体（包括相关的阳性和阴性对照复制子）分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR、R.luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

体外转录法大量制备登革2型病毒RNA

登革病毒在复制过程中不形成DNA中间体,要在基因水平研究其特征存在一定的困难,因为突变、重组、克隆等分子生物学技术都是在DNA水平上的操作.体外转录制备感染性RNA(感染性转录体)技术提供了解决这一难题的新途径[1],它大致包括全长cDNA克隆的构建、体外转录和转染3个步骤.由于RNA易于降解,在转染敏感细胞时就需要大量的感染性转录体.本研究采用Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems,对带有登革2型病毒全长cDNA的质粒QH-04/MON501,TB62,TB203进行了体外转录.在对转录反应中各加入成分的比例进行调试后,能在体外大量制备登革2型病毒RNA.     

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用     

端粒酶为靶点的溶瘤病毒的抗肿瘤作用研究

目的:通过临床前体外实验研究观察溶瘤病毒CNHK300对各种乳腺癌细胞的特异性杀伤作用.方法:通过 TRAP-ELISA方法,确认各种乳腺癌细胞和正常成纤维细胞中的端粒酶活性.Western印迹检测腺病毒CNHK300 E1A在端粒酶阳性肿瘤细胞和阴性正常成纤维细胞中的表达差异.通过荧光显微镜观察病毒在细胞中感染和复制的过程.行病毒增殖实验,验证溶瘤病毒 CNHK300在端粒酶阳性乳腺癌细胞中选择性复制能力;MTT方法行细胞生长抑制实验,检测CNHK300对端粒酶阳性乳腺癌细胞的选择性杀伤能力.结果:各种乳腺癌细胞 MCF-7、BT-549和 SK-BR-3的端粒酶均为阳性,MRC-5和 BJ细胞的端粒酶均为阴性.CNHK300病毒的E1A可以选择性在端粒酶阳性的乳腺癌细胞株和转染 E1A的293细胞中表达,而在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株中不表达.CNHK300病毒可以选择性在乳腺癌细胞中复制并杀伤肿瘤细胞,而在正常细胞中复制明显减弱,同时杀伤作用明显下降.结论:本研究证明,hTERT启动子可以用于调控腺病毒E1A选择性在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达,并调控病毒在肿瘤细胞中选择性复制,最后产生溶瘤作用.溶瘤病毒可能为肿瘤治疗提供一种新的有力武器.     

登革病毒的感染及复制研究进展

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属,是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒。其包膜蛋白E与细胞受体的结合介导病毒进入细胞,随后在感染细胞浆内复制。随着对非结构蛋白的深入研究,发现NS1、NS2A、NS3、NS4A及NS5蛋白均参与了病毒复制合体的形成,在成熟病毒颗粒的最终形成过程中,需要NS2B／NS3蛋白酶对C蛋白前体的切割及缩主细胞的糖基转移酶对prM、E蛋白糖侧链的正确加工。本文综述了登革病毒受体、病毒的复制及装配过程等方面的最新研究进展。     

登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响

目的：分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响。方法：利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平。结果：获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现△α1复制子复制水平明显下降。结论：登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用。     

西尼罗病毒Chin-01株5''非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究

目的 研究西尼罗病毒Chin-01株5'非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据.方法 通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5'UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性.结果 5'UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低.第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合.同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低.结论 Chin-01株5'UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点.     

虫媒黄病毒基因组复制的分子机制研究进展

虫媒黄病毒包括多种重要的可导致人类疾病的病原体.对其基因组复制的分子机制的研究一直是此类病毒致病机制研究的重点.本文着重介绍病毒基因组末端与其复制相关的调控元件、病毒非结构蛋白及宿主蛋白在虫媒黄病毒基因组复制中的作用.     

SARS-CoV-2非结构蛋白16研究进展

在新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染过程中,病毒编码的非结构蛋白（NSP）在宿主细胞内先于病毒RNA产生,首先形成复制-转录复合体,SARS-CoV-2基因组依赖复制-转录复合体得以在宿主细胞内完成正常复制。该文对在SARS-CoV-2感染早期出现并参与病毒RNA合成的非结构蛋白16(NSP16)的结构和生物学功能及其药物研究进展进行综述,为SARS-CoV-2引发疾病的预防和治疗提供新思路。     

DDX41蛋白通过活化IRF3抑制乙型肝炎病毒的复制

目的 探讨含DEAD框解旋酶41 (DDX41)基因对乙型肝炎病毒(HBV)复制能力的影响及其作用机制.方法 通过慢病毒包装将稳定过表达DDX41或特异敲低DDX41的短发卡RNA (shRNA)重组质粒转染至HepG2.2.15细胞系,筛选和建立稳定过表达或敲低DDX41的细胞株;通过CRISPR-Cas9技术构建敲除DDX41的HepG2.2.15细胞株;蛋白免疫印迹法检测DDX41蛋白表达水平以及通路验证;酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达水平;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测HBV复制相关DNA、RNA以及干扰素mRNA表达水平;Noahern印迹法检测HBV总RNA.结果 过表达DDX41可显著抑制HepG2.2.15细胞系中HBV的复制;而敲低或敲除DDX41可显著促进HepG2.2.15细胞系中HBV的复制.过表达DDX41可显著促进干扰素调节因子3(IRF3)的磷酸化和干扰素β(IFN-β)的表达;而敲低或敲除DDX41可显著抑制IRF3的磷酸化和IFN-β的表达.结论 在肝癌细胞系HepG2.2.15中,DDX41蛋白通过促进IRF3的磷酸化并诱导干扰素β的表达,进而发挥抑制HBV复制的功能.     

A-H1N1肺部感染临床影像表现与病理机制

甲型流感病毒（A—H1N1）和乙型流感病毒由8段890～2341个核酸组成的单链RNA套膜病毒。现在只有H1N1和H3N2的亚型病毒在人类之间传播（图1）。病毒复制传播的条件：进人人类身体内并进行复制、使人类生病、能容易地在人与人之间传播。A—H1N1复制仪限于呼吸系统上皮细胞。当有病毒进入细胞,它会导致复杂的细胞病变,使柱状上皮细胞停止细胞本身的蛋白质合成,细胞缺少了本身必须的细胞蛋白而导致细胞的死亡。     

人MDC1基因shRNA反转录病毒载体的构建及鉴定

目的 建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在官颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响.方法 将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiRNA-MDC1.经PT67细胞包装后,产生的莺组反转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆.采用RT-PCR和Western blotting检测细胞中MDC1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 重组psiRNA-MDC1质粒经测序鉴定正确;重组反转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blotting检测人MDC1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未十扰组.结论 携带人MDC1基因RNA干扰双链DNA片段的反转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MDC1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MDC1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

细胞外RNA的研究进展

细胞外RNA是存在于细胞外以结合或游离形式存在的一类RNA分子,它不仅在生命过程中起着非常重要的作用,而且可以作为疾病诊断有力的分子标志.细胞外RNA主要包括细胞膜结合RNA、循环系统RNA和细胞外基质中的RNA.本文就细胞外RNA的发现、分类及应用前景进行了综述.     

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区（UTR）中复制相关元件的功能研究

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。     

LSM14A蛋白通过活化IRF3抑制乙型肝炎病毒的复制

目的 探讨RNA相关蛋白LSM家族成员14A(LSM14A)在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的功能及其潜在的分子机制.方法 通过慢病毒包装方法构建稳定敲低LSM14A的HepG2.2.15细胞株和稳定过表达LSM14A的HepG2.2.15细胞株,利用CRISPR/Cas9技术构建LSM14A敲除的HepG2.2.15细胞.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western印迹)检测敲低、过表达和敲除效果.利用RT-qPCR和Northern印迹杂交检测HBV RNA的表达水平;RT-qPCR检测HBV DNA的表达水平;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达水平.利用Western印迹检测下游分子,RT-qPCR检测干扰素的分泌.结果 在HepG2.2.15细胞中过表达LSMJ 4A可显著抑制HBV的复制,而敲低或敲除LSM14A可显著促进HBV的复制.过表达LSM14A后,p-TBK1、p-IRF3、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的表达水平均显著增加.结论 在HepG2.2.15细胞中LSM14A蛋白通过促进IRF3的磷酸化诱导Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的表达,进而抑制HBV的复制.     

δ因子在成人中的意义

δ因子是在急慢性乙型病毒性肝炎(HBV)病人中复制的RNA病毒.δ抗原外面为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)所覆盖;并与病毒的RNA基因有关.1977年Mario Rizzetto首先报道在急慢性HBV病人的肝细胞核内发现了δ抗原.δ抗原可引起全身性免疫反应,首先是IgM应答;随后是IgG应答.将HBsAg自病毒颗粒分离后,就可以测出血清中的δ抗原以诊断某些急性感染.对这组病人,目前最好的诊断方法,用IgM型抗-δ免疫技术.对慢性感染者,用直接免疫荧光和免疫酶技术,可在固定和非固定的肝组织中找到δ抗原.此外,δ因子反复复制时,血清中常存在IgM抗δ,同时又与肝脏内δ因子密切相关.近代用cDNA探子来测定血清中的δ-RNA,证实了δ-RNA与δ因子的反复复制有密切关系,而且还证实肝脏内有δ抗原的存在.