TT病毒结构蛋白抗原在大肠杆菌中的表达及应用

目的　用原核系统表达TT病毒 (TTV)的重组蛋白抗原 ,建立诊断 (TTV)感染的特异性方法。方法　采用PCR方法扩增TTVORF2 基因 ,将之插入到测序质粒载体中进行测序 ,验证序列正确后将之嵌入到原核表达载体pQE30中 ,并转化大肠杆菌M15菌株 ,进行诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后 ,得到纯度为 90 %的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了West ern -Blot分析 ,用间接ELISA方法检测血清抗 - (TTV)IgG抗体。结果　经IPTG诱导后 ,筛选出 2株高表达株。结论　该蛋白具有良好的抗原活性 ,可以有效地用于TTV的感染检测中     

TT病毒结构蛋白抗原在大肠杆菌中的表达及应用

目的 用原核系统表达TT病毒（TTV）的重组蛋白抗原，建立诊断（TTV）感染的特异性方法。方法 采用PCR方法扩增TTVORF2基因，将之插入到测序质粒载体中进行测序，验证序列正确后将之嵌入到原核表达载体pQE30中，并转化大肠杆菌M15菌株，进行诱导表达。用SDS－PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后，得到纯度为90％的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot分析，用间接ELISA方法检测血清抗－（TTV）IgG抗体。结果 经IPTG诱导后，筛选出2株高表达株。结论 该蛋白具有良好的抗原活性，可以有效地用于TTV的感染检测中。     

基于纳米抗体CDR3区抗原表位展示的β-HCG 抗体制备及鉴定

摘要：目的 通过纳米抗体CDR3区展示β-HCG C端表位的方式,验证纳米抗体在抗原表位展示中的作用。方法 采用基因合成的方法,将β-HCG C端表位（氨基序列151~165）插入到纳米抗体CDR3区,酶切、连接原核表达载体pET24a,IPTG诱导表达。将His标签填料纯化得到的高纯度目的蛋白免疫新西兰大耳白兔,经5次免疫后,间接ELISA检测效价,抗原偶联纯化介质进行免疫多抗纯化,Western blot进行多抗特异性检测。结果 成功构建原核表达重组载体,并获得高表达菌株,IPTG诱导后,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,亲和层析获得纯度大于98%的目的蛋白,包涵体经复性后免疫,效价可达1∶512 000,Western blot特异性检测显示免疫多抗能够特异性结合β-HCG。结论 纳米抗体CDR3区β-HCG抗原C端表位展示的方法,可用于抗β-HCG抗体的制备,并为今后纳米抗体表位展示相关研究奠定基础。     

真菌免疫调节蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

目的通过在大肠杆菌中表达真菌免疫调节蛋白LZ-8,以制备高效价的抗体。方法将所克隆的LZ-8基因构建成原核表达载体pET-30a-lz8,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导其表达；原核表达产物经金属镍离子螯合柱纯化后,采用常规方法制备家兔多克隆抗体,并用间接ELISA法测定阳性血清的效价。结果大肠杆菌表达产物经SDS-PAGE电泳检测到相对分子量约为14ku的目的蛋白；用考马斯亮兰法测定所表达的外源蛋白表达量为34．46mg/L；纯化后的目的蛋白免疫家兔后,经间接ELISA检测阳性血清的稀释比例达到了10~4,证明该蛋白具有良好的抗原性。结论真菌免疫调节蛋白LZ-8能够在大肠杆菌中获得高水平的表达,且获得了高效价的家兔多克隆抗体,为以后对该蛋白的功能研究打下了基础。     

结核分支杆菌分泌蛋白Mtb81克隆、表达、纯化及血清学诊断价值的初步研究

目的 通过结核分支杆菌Mtb81基因在大肠杆菌中的表达, 获得大量纯化的重组Mtb81蛋白.通过Western -blot和ELISA方法评价Mtb81抗原,检测血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性,为进行结核病血清学诊断打下基础.方法 应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37Rv Mtb81DNA序列;构建pET24b-Mtb81重组质粒,然后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3);通过Western-blot鉴定重组Mtb81蛋白,采用Chelating Sepharose Fast Flow纯化重组 Mtb81蛋白;将纯化的重组Mtb81蛋白通过Western-blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测结核病人及正常人血清中的抗体,应用Microsoft Excel软件统计分析实验数据.结果 pET24b-Mtb81在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%左右.纯化后的Mtb81样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度为95%左右.纯化后的Mtb81蛋白通过Western-blot鉴定,结果显示:加入结核病人血清抗体于目的蛋白位置有一条显色带,而加入正常人血清组则无显色反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测30例结核病人及正常人血清中的抗体,结果显示:rMtb81的特异性和灵敏度分别为96%、93%.结论 pET24b -Mtb81大肠杆菌工程菌株能高效表达Mtb81蛋白,Western-blot结果证明表达蛋白具有很好的免疫反应性和抗原特异性;ELISA结果证明重组Mtb81检测结核病人血清中的抗结核抗体,具有较高的灵敏度和特异性.     

郑州市区儿童幽门螺旋杆菌感染状况分析

目的 探讨郑州市区儿童幽门螺旋杆菌(Helicobacter,Pylori,HP)感染状况及相关因素.方法 以郑州市区1～14岁儿童为研究对象,采用血清酶联免疫吸附技术(ELISA)检测血清HP-IgG抗体及ELISA双夹心法检测粪便HP抗原.结果 HP感染阳性率为38.04%(248/652),随年龄增加,HP感染阳性率逐渐升高.父母有胃病史、低人均居住面积、啃手指、不良卫生和生活习惯是造成本地区HP感染的重要因素.结论 本地区儿童HP感染仍处于高感染水平,随年龄增高HP感染有增高趋势,并与个人卫生及生活习惯、家庭居住条件密切相关,呈现家庭内聚集现象.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位融合肽在大肠杆菌中的表达与纯化

构建霍乱毒素B亚单位(CTB)与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(Ure B)表位的融合肽表达载体pET-CtUBE,在E.coliBL21(DE3)中表达融合肽CtUBE。以霍乱弧菌基因组DNA为模板,PCR扩增CTB编码序列,克隆到表达载体pET-28a,获得新质粒pET-CTB;化学合成Ure B表位编码序列,克隆到pET-CTB获得CtUBE表达载体pET-CtUBE,并转化E.coliBL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导融合肽表达,阴离子交换色谱柱纯化融合肽CtUBE,ELISA分析CtUBE复性结果。结果获得了表达融合肽CtUBE的工程菌,诱导后融合肽表达量占菌体总蛋白34.7%,CtUBE纯化后纯度为95.6%,复性后融合肽可与GM1神经节苷脂和抗Ure B血清结合。实验成功构建了表达Ure B表位融合肽的工程菌,融合肽CtUBE保持了CTB生物活性和反应原性,纯度符合疫苗抗原要求,可以用于抗HP感染的疫苗研制。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原的设计、表达与鉴定

构建空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,免疫动物后检测其抗血清与空肠弯曲菌菌体的反应性。从空肠弯曲菌的6个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段,将其插入原核表达载体,获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,经IPTG诱导后表达出25k的目标蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,Western blot和间接ELISA检测重组蛋白抗原性和抗血清反应性。结果表明目标蛋白具有良好的反应原和免疫原性,抗血清能与菌体发生反应。其抗体可用于C.jejuni免疫磁珠和免疫胶体金等检测方法的建立。     

抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 表达空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体.方法 诱导培养工程菌E coli BL21 (DE3)表达空肠弯曲菌PEB1重组蛋白.经镍-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,透析并定量后,常规免疫新西兰兔.收集血清,盐析法粗提IgG,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测抗体效价,并通过Western blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性.结果 得到高纯度的空肠弯曲菌PEB1重组蛋白.用该蛋白免疫新西兰兔后,获得抗PEB1多克隆抗体.间接ELISA法检测抗体效价为1:2×104,双向琼脂扩散试验检测抗体效价为1:8.结论 运用纯化的空肠弯曲菌PEB1重组蛋白免疫新西兰兔,获得高效价的多克隆抗体.     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

灌洗法检测减毒鼠伤寒杆菌疫苗对幽门螺杆菌的免疫应答

目的应用高渗灌洗液法(灌洗法)检测表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌活菌重组疫苗口服免疫小鼠后的免疫应答状况。方法将能表达UreB的重组减毒鼠伤寒杆菌SL326l/pTC01-UreB口服免疫Balb/c小鼠,12周后应用灌洗法或将小鼠处死直接获取小鼠肠液,检测小鼠的肠液和血清中针对UreB的特异性IgA和IgG抗体反应。结果疫苗组小鼠的肠液和血清中可分别检测到针对UreB的特异性IgA和IgG抗体,与对照组存在显著性差异(P<0.01)。灌洗法获取的小鼠肠液中的IgA抗体含量较将小鼠处死后直接获取的肠液中的IgA抗体含量明显为高(P<0.01)。病理学检查显示疫苗组小鼠胃粘膜炎症指数无改变。结论高渗灌洗液法是获取肠道抗体的理想方法;表达HpUreB的减毒鼠伤寒杆菌SL326l/pTC01-UreB可用作抗Hp感染的口服疫苗。     

重组人乳头瘤病毒16型L1 VLP的初步纯化、鉴定及免疫效果的初步研究

目的 对昆虫细胞-杆状病毒系统表达的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型L1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)进行初步纯化研究,并在小鼠中检测纯化VLP的免疫原性.方法 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化方法纯化HPV16 LI VLP.对纯化得到的VLP分别进行蛋白印迹法、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及电镜鉴定.然后用VLP免疫6周龄BALB/c小鼠.将小鼠随机分成6组(3个剂量组、2个佐剂组和1个对照组),间隔2周免疫3次,3次剂量相同.取血分离血清,采用间接ELISA法检测抗HPV16 L1 VLP抗体滴度.结果 经蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化后,用SDS-PAGE鉴定纯化的HPV16 LI VLP,纯度达到90%.电镜观察可见完整的VLP颗粒.间接EUSA检测结果显示,剂量组及佐剂组小鼠血清中均可检测到特异性抗HPV16 L1 VLP抗体,且抗体滴度随针次和剂量的增加而增高.结论 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化法得到的HPV16 L1 VLP可用于免疫学初步研究.通过昆虫细胞表达产生的HPV16 LI VLP 具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强的体液免疫应答.     

Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。     

肺炎支原体P1重组蛋白的免疫活性研究

提取纯化肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae,Mp）P1重组蛋白,对其免疫活性进行鉴定。将重组质粒pQE30-P1转入M15菌株,用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE分析重组蛋白的相对分子量,免疫印迹实验鉴定其免疫反应性,并用ELISA实验测定重组蛋白抗原的特异性。经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为58kD,免疫印迹实验和ELISA实验证实,Mp免疫血清和Mp感染患者血清都能与重组蛋白发生特异反应。重组蛋白具有特异的免疫反应性,可用于临床标本检测。     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体间接酶联免疫吸附分析法的建立

目的建立以重组心肌肌钙蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附分析法(ELISA),检测人血循环中的抗cTnI自身抗体,为判断心肌损伤的预后提供依据。方法采用自行构建表达的cTnI-C融合蛋白作为包被抗原,以棋盘法优化实验条件,建立检测人血清cTnI自身抗体的间接ELISA方法。采用建立的间接ELISA法在121例急性心肌梗死(AMI)中筛查抗cTnI自身抗体,并用蛋白印迹法(WB)进行确证。结果 121例AMI血清抗cTnI抗体的阳性率为10.74%,ELISA试验的灵敏度100%,特异性95.37%,Kappa值为0.815。结论以cTnI-C融合蛋白作为包被蛋白建立的间接ELISA法具有良好的敏感度、特异性,可用于人血清抗cTnI自身抗体的筛查。     

APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

应用纯化抗原检测唾液尿液和血清抗幽门螺杆菌抗体的比较

目的 寻求敏感性高、特异性强的幽门螺杆菌(helicobacter pylori,H．pylori)抗原和简便、可靠的检测H．pylori抗体的方法,用于诊断H．pylori感染。方法以多株H．pylori超声上清、重组H．pylori热休克蛋白A亚单位(rHspA)纯品和重组H．pylori热休克蛋白尿素酶B亚单位(rUreB)纯品混合物为抗原,采用EUSA方法对96例患者的唾液、尿液和血清同时进行检测。结果 使用rHspA和rUreB混合纯品进行检测,特异性和敏感性明显优于H．pylori超声上清。诊断H．pylori感染的优劣顺序为：血清IgG、尿液IgG、唾液IgG、血清Iga、唾液IgA。结论 混合基因工程纯化抗原进行H．pylori感染的检测,具有良好的临床应用前景。     

Tipα基因原核表达质粒的构建及其诱导条件的优化

目的 构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)基因的原核表达载体,并优化诱导实验条件使其在大肠杆菌中表达.方法 提取幽门螺杆菌(H pylori) 26695菌株总DNA,用PCR方法扩增位于H.pylori 0596的Tipα基因编码序列.将Tipα基因与pET29a载体同时经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切、纯化及连接后,构建pET29a-Tipα原核表达质粒,转化至宿主菌Top10F'中.优化实验条件使pET29a-Tipα原核质粒表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot方法进行鉴定.结果 pET29a-Tipα原核表达质粒经双酶切证实插入片段分子量为519 bp DNA条带,测序结果与H.pylori 0596的Tipα基因编码序列相一致.当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0 mmol/L,30℃诱导培养4h时,诱导目的蛋白表达量最高.Western blot结果证实,表达的重组蛋白可与Tipα抗体产生分子量约为21.8 KD的特异性条带.结论 成功构建了pET29a-Tipα原核表达质粒,并优化实验条件使其在大肠杆菌中表达了Tipα重组蛋白.