V型腺病毒纤维蛋白基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建腺病毒纤维蛋白基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达,为腺病毒靶向性载体构建创造条件。方法：采用限制性内切酶技术,酶切腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,经多次亚克隆,最后完成克隆纤维蛋白基因并构建其真核表达质粒,用脂质体法将构建好的真核表达质粒瞬时转染COS-7细胞,于转染后72h,用Western blot法检测所表达的蛋白。结果：克隆成功纤维蛋白基因,并构建纤维蛋白基因真核表达质粒pcDNA/Fiber,经限制性内切酶酶切鉴定及测序证实了其正确性,Western blot结果显示,新表达蛋白在变性条件下大小为62kD,而在非变性条件下为186kD。结论：纤维蛋白基因真核表达质粒能在真核细胞中表达,产物具有三聚体结构。可用于腺病毒靶向性载体的构建。     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

KiSS-1基因转染子宫内膜癌HEC-1B细胞系及其意义的研究

目的:构建KiSS-1基因质粒并将KiSS-1基因质粒导入子宫内膜癌细胞HEC-1B中,建立稳定、高效和低毒的转染方法,观察其转染率及表达情况。方法:采用基因转染技术用阳离子脂质体介导将高纯度的KiSS-1质粒转染到子宫内膜癌细胞株中。用RT-PCR和Western blot技术检测转染前后肿瘤细胞的KiSS-1 mRNA、MMP-9 mRNA和蛋白Metastine的表达。结果:1)使用重组的真核表达载体,将KiSS-1基因转染到子宫内膜癌细胞中,并获得稳定表达。2)子宫内膜癌细胞KiSS-1基因转染前后表达水平有明显差异,空白对照组、空质粒组和质粒转染组HEC-1B细胞中KiSS-1 mRNA蛋白的相对表达量分别为0.1231±0.0366、0.1486±0.0287和0.5060±0.0198,Metastin蛋白的相对表达量分别为0.1549±0.0189、0.1497±0.0029和0.4469±0.0078,质粒转染组与其他两组相比,差异有统计学意义,F=161.547,P=0.000;F=607.993,P=0.000。3)转染后的子宫内膜癌细胞的MMP-9 mR-NA表达下调,空白对照组、空质粒组和质粒转染组HEC-1B细胞中MMP-9 mRNA的相对含量分别为0.3576±0.0501、0.3500±0.0254和0.1677±0.0014,质粒转染组与其他两组相比,差异有统计学意义,F=32.963,P=0.001。结论:利用脂质体作为载体将KiSS-1基因转染到子宫内膜癌HEC-1B细胞是可行、有效和稳定的;转染后细胞的KiSS-1 mRNA表达明显增强,MMP-9 mRNA的表达明显降低;KiSS-1基因可能参与抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和转移,可考虑为子宫内膜癌基因治疗的一个有意义的基因。     

人TIMP-2基因真核表达质粒的构建及其表达研究

目的构建人T IM P-2基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达。方法利用RT-PCR方法获得人T IM P-2基因cDNA,以pcDNA 3为载体构建真核表达质粒pcDNA 3/T IM P-2,采用脂质体介导基因转染技术将重组质粒DNA导入CHO细胞中,加入G 418对转染细胞进行筛选获得稳定转染细胞,采用W estern b lot对重组质粒的表达进行检测。结果酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA 3/T IM P-2构建正确,在转化细胞中检测到人T IM P-2的表达。结论成功构建人T IM P-2真核表达质粒并获得稳定表达人T IM P-2的CHO细胞株。     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

人Elf5基因真核表达质粒的构建及其亚细胞定位

目的：构建人Elf5真核细胞表达质粒,并研究其在乳腺癌MCF7细胞中的亚细胞定位。方法：PCR扩增人Elf5基因,将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建含人Elf5基因的真核表达质粒pEGFP-hElf5。利用酶切鉴定,DNA测序,免疫印迹及免疫荧光方法鉴定Elf5真核表达质粒及Elf5蛋白的亚细胞定位。结果：经酶切鉴定、DNA测序、免疫印迹方法确认Elf5基因成功导入真核表达载体pEGFP-C1。瞬时转染MCF7细胞,Elf5蛋白表达在细胞核中。结论：pEGFP-Elf5真核表达质粒构建成功,Elf5定位在细胞核中。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

人LY6D基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人LY6D真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达和定位。方法:提取HEK293T细胞的mRNA，反转录为cDNA。PCR扩增LY6D基因的CDS序列，并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定，并转染到工具细胞HEK293T中，提取细胞总蛋白进行Western blot检测。然后利用激光扫描共聚焦显微镜观察LY6D在HEK293T细胞内的定位，最后Q-PCR检测过表达LY6D真核表达载体影响EMT关键基因的表达。结果:LY6D基因cDNA的编码区序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中，酶切鉴定片断为387 bp，并进一步测序成功。Western blot检测到了pEGFP-LY6D融合蛋白的表达，分子量约为41 kDa。pEGFP-LY6D融合蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。过表达LY6D真核表达载体减少E-cadherin的表达。结论:成功构建了LY6D基因cDNA的CDS序列的真核表达载体，pEGFP-LY6D蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质，LY6D过表达可以降低E-cadherin的表达。     

慢病毒介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达

目的：探讨慢病毒系统介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的过表达,为进一步研究LKB1基因在子宫内膜癌的作用机制奠定基础。方法以PCR扩增LKB1克隆质粒获得全长cDNA,将LKB1 cDNA链接到慢病毒载体pWPI,构建慢病毒表达质粒LKB1/pWPI。通过与包装质粒pCMV-Dr8.74和pMD2.G共转染293T细胞进行病毒包装,用包装成功后的病毒液感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,以荧光定量PCR、Western blot法检测HEC-1A细胞中LKB1的相对表达量。结果成功扩增LKB1全长cDNA和构建LKB1重组慢病毒表达载体LKB1/pWPI。转染包装293T细胞后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞HEC-1A。转染后HEC-1A-LKB1-pWPI细胞中LKB1的表达率明显高于亲本细胞和空白对照细胞（P〈0.01）。结论成功构建携带LKB1基因的慢病毒表达载体,包装病毒后能有效地感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,为进一步探讨LKB1基因在子宫内膜癌中的生物学效应奠定了基础。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

重组人 ZNF278 促进胃癌细胞系 SGC7901 增殖的研究

目的：构建pcDNA3．1-ZNF278重组人真核表达质粒,研究ZNF278对胃癌细胞增殖和周期的影响。方法：PCR扩增正常人胃黏膜组织中的ZNF278基因,并用EcoRI和HindIlI双酶切,与酶切后的pcDNA3．1-myc—his载体连接,转化DH50t大肠杆菌,克隆筛选,提取重组质粒,酶切鉴定并测序。重组人ZNF278真核表达质粒转染胃癌细胞系SGC7901,定量PCR和Westernblot技术检测ZNF278表达状况,利用MTr和细胞记数法检测细胞增殖,同时分析细胞周期变化。结果：测序证实pcDNA3．1-ZNF278真核表达质粒构建成功,并成功转染SGC7901细胞,检测确认ZNF278表达上调,转染重组pcDNA3．1-ZNF278质粒的SGC7901细胞较对照组生长加快,促进细胞周期进入s期。结论：pcDNA3．1-ZNF278重组质粒构建成功,并可促进胃癌细胞系SGC7901细胞增殖和细胞进入分裂期。     

TSLC1真核表达载体的构建及在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建TSLC1真核表达载体,并转染到肝癌细胞HepG2中使之表达,为研究TSLC1的抗肝癌作用奠定基础。方法利用RT-PCR技术扩增TSLC1基因全长,并与真核表达载体pRe-ceiver-M29进行连接;应用双酶切、PCR以及测序鉴定此连接载体;脂质体Lipofectamine 2000介导重组载体转染到HepG2细胞中,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR和免疫组化法检测其表达。结果RT-PCR获得了约1 329 bp大小的TSLC1基因片段;经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实TSLC1基因片段正确插入真核表达载体pReceiver-M29中;与对照组比较,RT-PCR方法可见显示转染组细胞TSLC1mRNA表达明显增多,免疫组化法可见显示转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pReceiver-M29-TSLC1,建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

HBx基因重组腺病毒载体构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:利用pAdEasy1腺病毒载体系统构建人HBx基因重组腺病毒,感染肝癌细胞株SMMC7721使HBx基因有效表达。方法:自真核表达载体pcDNA3.1(-)HBx中获得HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中构建pAdTrackCMVHBx,然后经PmeⅠ酶切线性化,电转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中。挑选和鉴定正确的同源重组质粒,然后将线性化的重组质粒转染293N细胞,产生重组病毒颗粒,并进一步感染SMMC7721细胞株。结果:经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pAdTrackCMVpAdEasy1HBx重组成功,借助荧光显微镜可以观察到绿色荧光蛋白GFP在293N和SMMC7721细胞株中表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,并在SMMC7721细胞中使HBx基因有效表达,为后续研究奠定了基础。     

肿瘤转移抑制基因KAI1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭能力的影响

目的:探讨肿瘤转移抑制基因KAI1基因对子宫内膜癌细胞(AN3CA和HEC-1-B)增殖及侵袭能力的影响。方法:脂质体介导pcDNA3-KAI1质粒转染人子宫内膜癌细胞AN3CA和HEC-1-B,采用免疫印迹法和流式细胞术检测转染前后肿瘤细胞KAI1蛋白的表达,MTT比色法、软琼脂克隆形成实验观察KAI1基因对肿瘤细胞增殖能力的影响,Transwell侵袭实验检测转染前后肿瘤细胞侵袭能力的变化。结果:转染pcDNA3-KAI1质粒后AN3CA和HEC-1-B细胞内和细胞表面均可检测到KAI1蛋白的稳定表达。转染空白质粒组细胞形成克隆数量多体积较大,细胞克隆形成率为(54.2±3.1)%和(52.7±4.3)%,细胞的倍增时间为21.3h和20.1h;基因转染pcDNA3-KAI1质粒组细胞形成克隆数少体积较小,细胞克隆形成率为(37.4±5.1)%和(32.1±3.7)%,细胞的倍增时间为43.7h和45.2h;两组间细胞增殖能力和克隆形成能力比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。基因转染组细胞的穿膜细胞数为(91±10.7)/HT、(68±10.8)/HT,而空质粒转染组细胞的穿膜细胞数为(292±11.5)/HT、(219 12.7)/HT,两组细胞比较,侵袭能力亦显著下降(P<0.05)。结论:外源性肿瘤转移抑制基因KAI1有效转染可使子宫内膜癌细胞增殖、侵袭能力均下降,KAI1可能成为子宫内膜癌转移的新治疗靶点。     

苏拉明对人子宫内膜癌细胞增殖和乙酰肝素酶表达的影响

目的 通过用苏拉明（suramin）处理体外培养的人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1-B，观察其对子宫内膜癌细胞增殖和乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）表达的影响，探讨苏拉明治疗子宫内膜癌的可能性。方法 用不同浓度的苏拉明处理体外培养的人子宫内膜腺癌细胞HEC-1-B，分别在处理后的不同时间点，以MTT法检测HEC-1-B细胞增殖的情况，倒置相差显微镜观察细胞形态改变，免疫细胞化学染色法检测HPSE表达水平的改变。结果 苏拉明处理HEC-1-B细胞5d后HEC-1-B的增殖活性与时间剂量呈负相关（P〈0．01）。免疫细胞化学染色法结果表明不同浓度的苏拉明处理细胞96h后HPSE的表达无明显变化。结论 苏拉明能够抑制人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1-B的增殖。苏拉明对HEC-1-B细胞HPSE的蛋白表达无影响。苏拉明能否用于人子宫内膜癌的治疗，有待于进一步的研究。     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。