酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白*

目的：筛选鉴定新的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B viral X protein,HBX）相互作用蛋白。方法：以HBX为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4 DBD（DNA binding domain）融合表达,将人肝脏cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区（activation domain）融合表达。通过酵母双杂交筛选鉴定肝脏中与HBX相互作用的蛋白。筛选得到的阳性酵母转化子,经质粒提取和测序后,分析其所包含的序列编码的蛋白,通过再次验证,初步确定该蛋白是否与HBX具有相互作用。结果：筛选得到5个潜在的能与HBX相互作用的蛋白。结论：通过酵母双杂交cDNA文库筛选,得到多个潜在的HBX相互作用蛋白,进一步的验证及功能研究将对揭示HBX促进肝癌发生的机制起到重要的推动作用。     

FTH1真核表达载体的构建与鉴定

目的构建携带人铁蛋白重链多肽1（FTH1）基因的真核表达载体pCMV－Myc-FTH1,为研究FXR1P与FTH1体内相互作用奠定基础。方法以人胎脑cDNA文库为模板进行聚合酶链反应（PCR）特异扩增FrH1基因片段,将扩增片段经EcoRI和XhoI双酶切后克隆到同样经EcoRI和XhoI双酶切的pCMV－Myc载体,酶切鉴定阳性克隆并进一步测序鉴定。结果成功构建了pCMV－Myc—FTH1重组真核表达载体。结论pCMV－Myc—FFH1重组真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1P与VrH1相互作用奠定了基础。对研究FXR1在脆性x综合征中的作用机理提供了依据。     

FXR1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建携带人脆性X相关基因1(FXR1)的真核表达载体pCMV-HA,为研究FXR1P互作蛋白奠定基础。方法以pYESTrp3-FXR1为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增FXR1基因片断,将扩增片段经EcoR I和XhoI双酶切后克隆到pCMV-HA载体,酶切鉴定阳性克隆并测序鉴定。结果成功构建了pC-MV-HA/FXR1真核表达载体。结论pCMV-HA/FXR1真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1互作蛋白奠定了基础,从而对研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理具有深远意义。     

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

HSP70诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

目的：构建用于酵母双杂交系统的“诱饵”载体pGBKT7-Hsp70，并检测其是否具有自激活作用。方法：用PCR的方法从质粒pGBKT7-Hsp70中扩增出Hsp70基因片段，引入酶切位点EcoRⅠ，BamHⅠ，测序正确后，将Hsp70基因克隆至载体pGBKT7中，并检测pGBKT7-Hsp70在MATHMAK－ER GAL4 Two-Hybrid System3中的自激活作用。结果：成功构建了“诱饵”载体pGBKT7-Hsp70，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用。结论：pGBKT7-Hsp70可以用于酵母双杂交系统中，寻找与Hsp70相互作用的分子。     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

高通量筛选肿瘤转移相关基因的研究

目的 利用高通量双萤光素酶报告基因系统筛选与肿瘤转移相关的人类功能基因.方法 利用与肿瘤转移相关的重要因子——血管内皮生长因子(VEGF),将含有VEGF反应序列的萤光素酶报告基因(VEGF-LUC)质粒与409个待筛人类功能基因真核表达质粒共转染Hela细胞以筛选影响VEGF-LUC表达的人类功能基因,进一步通过Western blot在蛋白质水平验证初筛阳性的基因对细胞内VEGF蛋白表达量的影响.结果 染色质重塑蛋白4A (CHMP4A)明显增强VEGF-LUC相对萤光素酶值(P＜0.05),Western blot结果表明CHMP4A明显增强Hela细胞内VEGF的表达.结论 初步筛选到一个可能通过影响VEGF活性增强肿瘤侵袭性的基因CHMP4A.     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的启动序列ISRE4（4个串联的ISRE序列）和GAS7（7个串联的GAS序列）,与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

狨猴血清中重组人5型腺病毒中和抗体滴度的测定

目的构建表达荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP,检测血清中和抗体最佳实验方法, 分析小型灵长类动物普通棉耳狨猴体内腺病毒5型中和抗体水平,为评价腺病毒载体疫苗提供实验动物基础数据。方法利用 ADMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC315-Luc-GFP,将所得的穿梭质粒和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293A细胞, 进行重组人5型腺病毒（rAd5/Luc/GFP）的包装。通过3次空斑形成实验筛选出单克隆重组腺病毒,并在大量扩增单克隆腺病毒 后用CsCl密度梯度离心法进行浓缩纯化。采用TCID50法测定纯化后病毒滴度,并挑选进行中和实验的最优病毒滴度。将合 适病毒滴度的rAd5/Luc/GFP与狨猴血清混合预孵育后感染293A细胞,分别采用化学发光法及流式细胞术,对14只普通棉耳狨 猴血清中腺病毒5型中和抗体进行检测。结果PCR、酶切和测序结果均表明穿梭质粒pDC315-Luc-GFP构建成功;GFP检测 结果证明重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP包装扩增成功,病毒滴度可达6.9×1011.5 PFU/mL。两种不同方法检测检测14只狨猴 的中和抗体结果一致性较好（P<0.05,Kappa=0.811）,化学发光法或流式细胞术检测阳性狨猴比率分别为28.6%（4/14）或21.4% （3/14）,化学发光法检测得其中2只狨猴中和抗体滴度为1/16,另2只为1/32,而流式细胞术检测得滴度均为1/16。结论化学发 光法是一种快速,准确,适用于多物种的方法,其灵敏度略高于以GFP为报告基因的流式细胞术（7.2%）。普通棉耳狨猴体内 Ad5血清阳性率较低,有望应用基于此型或其他型别腺病毒作为载体进行基因治疗和基因疫苗研究。     

大鼠Caspase 8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响?同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136~+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用?另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase 8-1~4)?将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-Caspase 8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加?而将pGL3-Caspase 8-FL?pGL3-Caspase 8-1~4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3?提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336~-136 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域?     

人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的建立

目的建立靶向人高密度脂蛋白受体基因(CLA-1)调控序列的药物筛选模型,为筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂奠定基础.方法PCR扩增CLA-1上游调控序列,构建重组报告基因质粒pGL3-CLAP,瞬时转染人肝癌细胞BEL-7402,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂.结果建立了CLA-1表达上调剂筛选模型,pGL3-CLAP与阴性对照pGL3-Basic组间差异显著(P＜0.001),变异系数(CV)不超过10%.对124个化合物和800个微生物次级代谢产物进行初筛和复筛,1个化合物和3个菌株发酵液为阳性.结论该系统可有效地应用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂的高通量筛选.     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

细胞内活化的Notch途径报告基因质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定一种检测细胞内活化的Notch信号途径的报告基因质粒,用于研究该途径在宫颈癌细胞中的作用机制。方法构建报告基因质粒pTP1-EGFP-N1;测序及酶切鉴定后,与Notch的胞内段(NIC)共转染宫颈癌Hela细胞,观察其表达。结果构建了报告基因质粒pTP1-EGFP-N1,与NIC共转染Hela细胞后有阳性表达。结论该报告基因质粒的成功构建为进一步研究Notch信号途径在宫颈癌发生中的作用机制奠定了实验基础。     

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法:运用RT-PCR技术从卵巢癌细胞系Caov-3中扩增出Bit1基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果:成功获得Bit1基因片段,Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用. 结论:可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

广州管圆线虫半乳凝素基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫反应性研究

目的 构建在E.coli中高效表达广州管圆线虫半乳凝素蛋白的重组表达质粒,并对重组蛋白纯化条件进行优化及免疫反应性鉴定.方法 根据本室构建的广州管圆线虫幼虫cDNA文库EST测序结果,筛选出有诊断潜能的半乳凝素基因,经过PCR扩增其cDNA全长序列后克隆入pET32a( )载体进行诱导表达,包涵体经洗涤、变性、逐步透析复性,浓缩后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹.结果 本研究首次克隆出广州管圆线虫半乳凝素蛋白基因全长cDNA序列(GenBank收录编号为DQ384534).成功构建重组质粒pET32a( )-Ac GAL,通过IPTG诱导得到以包涵体形式表达的重组融合蛋白,Western-blot结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性.结论 克隆表达了广州管圆线虫半乳凝素基因,为广州管圆线虫病诊断研究奠定了基础.     

促Utrophin表达药物的筛选方法的建立与应用

目的：建立一种筛选促Utrophin表达药物的方法。方法：将含有utrophin基因下游增强子DUE和PA启动子以及LacZ报告基因的重组质粒转染小鼠成肌细胞C2C12细胞，以此作为细胞模型，筛选中药材样品库，筛选出能增强Utmphin表达的药物，得到的阳性药物分别给予C2C12细胞和BALB／c小鼠，检测Utrophin表达的变化。结果：得到佛手等3个在细胞和整体水平促进Utrophin表达的候选药物。结论：成功地建立了1种筛选促Utrophin表达药物的方法，为进一步开发杜兴氏肌营养不良症（DMD）治疗药物奠定基础。