甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达

目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达。结果RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达。结论本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的　构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。　方法　据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。　结果　成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。　结论　获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。     

SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定.用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况. 结果限制性内切酶分析与测序结果示H /K ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性.认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础.     

大鼠TIMP-1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建大鼠基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)的真核表达载体pTIMP-1,并在中国仓鼠卵母(CHO)细胞中表达.方法 从大鼠肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出TIMP-1基因的cDNA片段,将目的 片断克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定,然后将目的 片断酶切回收后插入pcDNA3.1,构建真核表达载体pTIMP-1,将该载体转染到CHO细胞后24～48 h,收集细胞上清同时制作细胞爬片,双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化检测TIMP-1的表达情况.结果 扩增出了长约654 bp的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定无误;将pMD-TIMP-1中TIMP-1基因亚克隆至pcDNA3.1载体,酶切鉴定无误;pTIMP-1载体转染CHO细胞后,ELISA法可检测到细胞上清中有大量TIMP-1的表达,同时细胞爬片免疫组织化学染色可见胞浆中存在明显的阳性棕染.结论 成功构建了大鼠TIMP-1基因的真核表达载体pTIMP-1,为进一步探讨其功能奠定了实验基础.     

结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体。方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达。结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB,furB基因可以在COS-7细胞中表达。     

溶藻弧菌热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建溶藻弧菌热休克蛋白70(HSP70)真核表达载体pcDNA3.1。方法提取溶藻弧菌基因组DNA,PCR扩增HSP70基因片段,克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将HSP70基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1重组质粒,通过PCR、酶切及序列分析对HSP70基因pcDNA3.1重组质粒进行鉴定。结果扩增出1 914bp的溶藻弧菌HSP70基因片段,并成功构建溶藻弧菌HSP70真核表达载体pcDNA3.1。结论成功构建了溶藻弧菌HSP70真核表达载体pcDNA3.1,为HSP70基因疫苗研制奠定了基础。     

人miR-205真核表达载体的构建及鉴定

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,并使其在肾上腺皮质癌细胞SW-13中稳定表达。方法依据miRbase数据库中pre-miR-205序列设计引物,PCR扩增pre-miR-205基因并将其克隆至线性化的pcD-NA3.1(+)质粒中,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,经双酶切及测序分析后,将其及对照空载体转染肾上腺皮质癌SW-13细胞,采用实时定量RCR法鉴定miR-205在SW-13细胞中表达。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1(+)-205重组质粒构建成功,经实时定量RCR检测表明转染pcDNA3.1(+)-205的SW-13细胞中miR-205阳性高表达。结论真核表达载体pcDNA3.1(+)-205在SW-13中稳定转染,为进一步研究miR-205在肾上腺皮质癌细胞SW-13中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。     

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在A549中的表达

目的 建立人核心蛋白聚糖(decorin,DCN) 真核表达载体,并在A549细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 用PCR法扩增出DCN分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染A549细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达.结果 获得了约1 080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中.RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和Western印迹方法可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染DCN的A549细胞株.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

人NPTX2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建入神经元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表达载体.转染人胰腺癌细胞PANC1,建立稳定转染的细胞系.方法 通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA,利用Not I和EcoR I酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序验证盾,用脂质体转染法转染PANC1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的PANC1细胞,用实时定量PCR方法筛选NPTX2 mRNA高表达克隆.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体.并建立了稳定转染的PANC1细胞,成功表达了目的 基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础.     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

携带GDNF基因转移的真核表达载体的构建及表达

目的 构建pcDNA3.1( )GDNF真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法 将GDNF逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物克隆至pcDNA3.1( )真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以Fu Gene 6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果 酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白。结论 以Fu Gene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒转染真核细胞为基因治疗帕金森氏病奠定了一定基础。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础.方法 从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体中.通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性.提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株.提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达.结果 从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基.测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列.转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P＜0.01.结论 成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体.获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株.     

幽门螺杆菌NCTC11637、NCTC11639毒素相关基因A的克隆、序列分析及真核表达载体的构建

目的克隆幽门螺杆菌毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)全长序列并进行序列分析,构建表达CagA的真核表达载体,研究CagA调控胃泌素基因的表达。方法PCR扩增出CagA基因全长片段后构建克隆载体pMD18-T/CagA7和pMD18-T/CagA9,测序结果登录GenBank,登录号分别为GQ161098(NCTC11637)和GQ161099(NCTC11639),用测序后筛选的PstI和BamHI内切酶将原核载体上的CagA基因酶切后连接到pcDNA3.1/ZEO(-)真核表达载体上,构建真核表达载体pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA3.1ZEO(-)/CagA9,并经双酶切和CagA PCR扩增鉴定,最后转染胃癌细胞,检测胃癌细胞中胃泌素基因的表达。结果序列比对结果显示NCTC11637和NCTC11637 CagA的同源性为88.77%,NCTC11637与已收录的NCTC11637(AB015416)同源性为99.22%,序列分析显示两者均有两个Ca-gA酪氨酸磷酸化位点,转染细胞后CagA上调胃泌素基因的表达。结论成功克隆了CagA全长基因,并构建了含CagA全长基因的真核表达载体,在胃癌细胞内上调了胃泌素基因的表达。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

HBV pre-X转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的:检测HBV Pre-X在真核表达栽体PcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X转染的HepG2细胞中的表达,并筛选其中的代谢相关差异表达基因.方法:将构建的真核表达载体pcDNA3.1-mychis-HBV pre-X转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:将pcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X和pcDNA3.1-myc-his载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA后逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因.结果:构建的真核表达载体经ApsI、BstXI双酶切鉴定,转染HepG2细胞后HBV pre-X表达经蛋白免疫印迹证实:经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是200个和62个.结论:筛选HBV pre-X转染HepG2细胞后的代谢相关差异表达基因,从而为乙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据.     

hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。