蟾毒灵诱导入肝癌细胞HepG2凋亡的作用及机制

目的:探讨蟾毒灵对人肝癌细胞系HepG2的凋亡诱导作用及其相关机制.方法:采用Annexin V-FITC/PI标记方法,观察蟾毒灵对HepG2细胞的凋亡诱导效应;用Western blot方法检测蟾毒灵对细胞凋亡相关蛋白及信号通路的影响.结果:①蟾毒灵能够诱导HepG2细胞凋亡.②蟾毒灵能够上调bax蛋白并下调bcl-2蛋白的表达水平.③蟾毒灵作用于HepG2细胞后,能够抑制PKB/Akt蛋白的磷酸化但促进JNK1/2的磷酸化.结论:蟾毒灵能够诱导HepG2细胞凋亡,该作用可能与其改变凋亡相关蛋白的表达水平和增殖相关信号通路的活化状态有关.     

蟾毒灵诱导伯基特淋巴瘤细胞凋亡及初步机制研究

目的 :探讨蟾毒灵(bufalin)对伯基特(Burkitt)淋巴瘤细胞的影响。方法:体外培养人伯基特淋巴瘤细胞株Daudi,以0、5、10、20、40、80 nmol/L浓度蟾毒灵处理细胞,细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞抑制率,膜联蛋白(annexin)Ⅴ/碘化丙啶(PI)双染后,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹(Western blotting)检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶及B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、c-Myc的变化,实时定量(real-time)PCR检测c-Myc RNA水平的变化。结果:CCK-8检测结果显示,蟾毒灵对Daudi细胞增殖有明显的抑制作用,呈药物浓度依赖性,且经48 h处理后的抑制率明显高于24 h,半数抑制浓度(IC50)为(20.03±2.56)nmol/L;流式细胞检测结果表明,蟾毒灵可诱导Daudi细胞发生凋亡;蛋白质印迹检测结果显示,不同浓度蟾毒灵处理Daudi细胞48 h后,胱天蛋白酶3、9及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)均出现明显剪切,并伴有Bcl-2及c-Myc癌基因的下调;实时定量PCR检测显示,c-Myc癌基因在m RNA水平也出现明显下调。结论:蟾毒灵能够诱导Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株发生凋亡,下调的c-Myc及Bcl-2癌基因可能参与了这一过程。     

蟾毒灵对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响

目的：研究蟾毒灵对人肝癌BEL-7402细胞增殖及细胞周期的影响。方法：采用MTT法观察蟾毒灵对人肝癌细胞增殖的抑制作用；光镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构；流式细胞术分析细胞周期分布情况。结果：蟾毒灵对肝癌细胞生长抑制作用呈浓度-时间依赖性，24、48和72小时的半数抑制浓度分别为6．67、0．348和0．228μmol／L，蟾毒灵可将细胞周期阻滞于G2／M期，透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论：诱导肝癌细胞周期G2／M期阻滞可能是蟾毒灵抑制肝癌细胞增殖的机制之一。     

蟾毒灵对人肝癌细胞增殖与侵袭的影响

目的:研究蟾毒灵(bufalin,Bu)对肝癌BEL-7402细胞生长、迁移侵袭的作用.方法:体外培养人肝癌BEL-7402细胞,应用CCK-8比色法、流式细胞仪、Transwell小室迁移侵袭实验观测不同浓度和作用时间Bu对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响.结果:Bu明显抑制肝癌BEL-7402细胞生长和增殖,呈浓度-时间效应关系;0.085μg/mL Bu分别作用于肝癌BEL-7402细胞48、72 h,肝癌细胞周期阻滞于G2/S期[48 h(G2:t=-6.618,P<0.01;S:t=-5.339,P<0.01),72 h(G2:t=-14.273,P<0.01;S:t=-4.812,P<0.01)];0.085μg/mL Bu作用肝癌BEL-7402细胞72 h,显著抑制肝癌细胞迁移(t=11.717,P<0.01)和侵袭(t=5.437,P<0.01).结论:Bu能抑制肝癌细胞迁移、侵袭,并且通过阻滞肝癌细胞周期于G2/S期,抑制肝癌细胞增殖,其生长抑制作用呈时间和剂量依赖效应.     

蟾毒灵对人肝癌多药耐药BEL-7402／5-FU细胞增殖活性的影响

目的研究蟾毒灵对人肝癌多药耐药BEL-7402／5-FU细胞增殖活性的影响。方法用噻唑蓝比色法观察蟾毒灵及5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿霉素、长春新碱对BEL-7402亲本及耐药细胞的抑制作用;流式细胞术检测1．00、0．10、0．01μmol／L蟾毒灵作用24h对细胞凋亡率及细胞周期的影响。结果BEL-7402／5-FU细胞对上述化疗药物均有不同程度的耐药性。蟾毒灵对BEL-7402亲本及耐药细胞24、48h的半数抑制浓度无统计学差异（P〉0．05）,可明显抑制BEL-7402／5-FU细胞生长。不同浓度蟾毒灵作用24h后的细胞凋亡率及IC50比较均有统计学差异（P均〈0．01）,且细胞G0／G1期降低,G2／M期升高,呈剂量依赖性（P〈0．01）。结论蟾毒灵对人肝癌多药耐药BEL-7402／5-FU细胞无交叉耐药性,有增殖抑制作用,且呈时间、浓度依赖,其作用可能通过阻滞细胞周期进程和诱导细胞凋亡实现的。     

胰腺癌细胞生长因子受体及其介导的信号转导通路

生长因子受体及其介导的信号转导异常被认为是肿瘤发生、发展的重要机制，成为近年来的研究热点。对胰腺癌细胞的多种生长因子受体及其介导信号的深入研究，在阐明胰腺癌的发病机制、预测及靶向治疗方面具有重要意义。     

丹参酮ⅡA对人胰腺癌细胞凋亡的诱导作用及其对SAPK/JNK信号转导通路的影响

目的:研究丹参酮ⅡA诱导人胰腺癌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的JNK信号转导通路,揭示其抗胰腺癌的部分机制.方法:MTT法观察丹参酮ⅡA对人胰腺癌PANC-1细胞的生长抑制作用;8、16、32 mg/L丹参酮ⅡA分别作用人胰腺癌PANC-1细胞48 h后,免疫荧光染色观察细胞凋亡情况;流式细胞仪法(FCM)检测细胞凋亡;...     

JNK信号通路介导的凋亡在疾病中的作用

c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs) 家族是丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPKs) 超家族的成员之一,也被称为应激活化蛋白激酶(stressactivated MAP kinases,SAPKs).JNK 能介...     

靶向5-LOX的siRNA诱导胰腺癌细胞的凋亡

目的:采用RNA干扰技术(siRNA)阻断5-LOX基因的表达,观察其抑制人胰腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用.方法:构建靶向5-LOx的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine-2000转染人胰腺癌细胞株SW1990,采用RT-PCR检测RNA干扰后5-LOX mRNA表达,MTT法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:靶向5-LOX序列特异性的三条siRNA(组1、组2、组3)可以有效地抑制SW1990细胞5-LOX基因表达,其表达抑制率分别为19.6%±1.9%、55.4%±2.6%和55.2%±2.7%.转染靶向5-LOX siRNA的三个质粒表达载体可以显著抑制SW1990细胞的增殖, 细胞接种24 h后,三组增殖抑制率分别为5.37%±1.19%、11.63%±1.25%和13.67%±1.04%:48 h后其增殖抑制率分别为16.13%±1.5%、26.63%±1.22%和25.47%±1.67%, 各siRNA组增殖抑制率高于空白组和阴性对照组(均P<0.05),转染后24 h和48 h三组细胞凋亡率分别为5.56%±1.05%、11.45%±1.44%、12.13%±1.36%和7.37%±1.23%、18.75%±1.5%和22.02%±1.45%,均高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05).结论:所构建的靶向5-LOX的siRNA质粒表达载体可以有效阻断SW1990细胞5-LOX基因表达,显著地抑制SW1990细胞增殖,并在一定程度上诱导其凋亡.     

c-jun氨基末端激酶信号通路与细胞凋亡

细胞凋亡是当前生物医学热门话题之一,近年来已取得很大进展:细胞凋亡是最常见的细胞生理性死亡形式,可发生于胚胎发育,组织重建,免疫调节及肿瘤退化的各个时期[1].它是一种与生俱来的机制,借此可去除机体不需要的细胞.细胞凋亡是在基因调控下的一个严密完整的程序化过程,以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段、细胞缩小、最终形成凋亡小体(apoptosis body)等形态变化为特征.细胞凋亡的诱导及调控过程十分复杂,涉及一系列相关分子及信号转导通路,目前尚处于揭示阶段.现已证明丝裂原激活的蛋白激酶家族可转导并调控细胞凋亡信号,而c-jun氨基末端激酶信号通路在其中起着十分重要的作用.     

Metformin induces apoptosis of pancreatic cancer cells

AIM：To assess the role and mechanism of metformin in inducing apoptosis of pancreatic cancer cells.METHODS：The human pancreatic cancer cell lines ASPC-1,BxPc-3,PANC-1 and SW1990 were exposed to metformin.The inhibition of cell proliferation and colony formation via apoptosis induction and S phase arrest in pancreatic cancer cell lines of metformin was tested.RESULTS：In each pancreatic cancer cell line tested,metformin inhibited cell proliferation in a dose dependent manner in MTS（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium assays）.Flow cytometric analysis showed that metformin reduced the number of cells in G1 and increased the percentage of cells in S phase as well as the apoptotic fraction.Enzymelinked immunosorbent assay（ELISA） showed that metformin induced apoptosis in all pancreatic cancer cell lines.In Western blot studies,metformin induced poly-ADP-ribose polymerase（PARP） cleavage（an indicator of caspase activation） in all pancreatic cancer cell lines.The general caspase inhibitor（VAD-fmk） completely abolished metformin-induced PARP cleavage and apoptosis in ASPC-1 BxPc-3 and PANC-1,the caspase-8 specific inhibitor（IETD-fmk） and the caspase-9 specific inhibitor（LEHD-fmk） only partially abrogated metformin-induced apoptosis and PARP cleavage in BxPc-3 and PANC-1 cells.We also observed that metformin treatment dramatically reduced epidermal growth factor receptor（EGFR） and phosphorylated mitogen activated protein kinase（P-MAPK） in both a time-and dose-dependent manner in all cell lines tested.CONCLUSION：Metformin significantly inhibits cell proliferation and apoptosis in all pancreatic cell lines.And the metformin-induced apoptosis is associated with PARP cleavage,activation of caspase-3,-8,and-9 in a time-and dose-dependent manner.Hence,both caspase-8 and-9-initiated apoptotic signaling pathways contribute to metformin-induced apoptosis in pancreatic cell lines.     

内分泌腺来源的血管内皮生长因子抑制胰腺癌细胞凋亡的信号转导机制研究

目的 探讨内分泌腺来源的血管内皮生长因子(EG-VEGF)在胰腺癌MiaPaCa细胞中抗凋亡作用及其相关分子机制.方法 以50、100、200 ng/ml EG-VEGF处理细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞p42/44MAPK、STAT3蛋白表达及其磷酸化,检测抗凋亡蛋白Mcl-1的表达.应用G蛋白耦联非特异受体阻断剂PTX、Rsa/ERK信号通路阻断剂PD98059和JAK/STAT3信号通路阻断剂AG490预处理细胞1 h,观察Mcl-1蛋白表达的变化.结果 100 ng/ml EG-VEGF可使MiaPaCa细胞的凋亡率从(28.4±4.6)%显著下降到(13.2±2.5)%(P<0.05).50 ng/ml的EG-VEGF处理后,MiaPaCaⅡ细胞p42/44MAPK的磷酸化增加(1.735 ±0.019)倍;STAT3的磷酸化增加(21.810±0.052)倍,均较对照组显著增加(P值均<0.05),但100、200 ng/ml EG-VEGF没有进一步增加蛋白的磷酸化.50 ng/ml的EG-VEGF处理后,Mcl-1蛋白的表达较对照组增加(3.460±0.002)倍,但100、200ng/ml EG-VEGF没有进一步增加蛋白的表达;应用PTX预处理后,Mcl-1蛋白表达的增加被完全抑制,用PD98059、AG490预处理后Mcl-1表达增加抑制率分别为52%和68%.结论 EG-VEGF可抑制MiaPaCa细胞的凋亡,其机制可能与激活Ras-MAPK和JAK-STAT3信号转导通路及增加Mcl-1蛋白的表达有关.     

Notch-1信号通路对胰腺癌BxPC3细胞增殖和凋亡的调控

目的探讨Notch-1信号通路对胰腺癌BxPC3细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养胰腺癌BxPC3细胞,用小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）的方法抑制Notch-1的表达,Western印迹方法检测Notch-1、Bcl-2及Bcl-xL蛋白表达情况;MTT法检测细胞增殖;ELISA法检测细胞凋亡。结果抑制Notch-1表达能明显抑制胰腺癌BxPC3细胞生长（P〈0．01）,显著下调Bcl-2和Bcl-xL水平,并使BxPC3细胞凋亡显著增多（P〈0．01）。结论Notch-1信号通路促进胰腺癌BxPC3细胞增殖,抑制胰腺癌细胞凋亡。     

蟾蜍灵联合奥沙利铂对胃癌MGC803细胞增殖抑制及凋亡的影响

目的 研究蟾蜍灵联合奥沙利铂诱导人胃癌细胞株MG C803凋亡及对凋亡因子Bax、Bcl-2的影响.方法 应用MTr法检测不同浓度蟾蜍灵及奥沙利铂单药及联合对胃癌细胞MGC803增殖抑制作用;流式细胞术分析细胞凋亡和周期阻滞;Western印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 (1)蟾蜍灵及奥沙利铂单药均抑制MGC803细胞增殖,呈剂量时间依赖效应,且联合用药的细胞增殖抑制率高于单药组,差异有统计学意义.24、48 h及72 h联合指数(CI)分别为0.693、0.596、0.481;(2)药物作用细胞24h,流式细胞仪检测10 nmol/L蟾蜍灵及10 μg/ml奥沙利铂凋亡率分别为2.9％及4.3％,联合用药组为14.13％,与单药组对比有统计学差异;(3)Western印迹结果显示,蟾蜍灵、奥沙利铂单用于胃癌细胞24h后,Bax及Bcl-2表达无明显变化,而联合组Bax蛋白表达上调到对照组145.94％,Bcl-2蛋白下调到对照组57.14％.结论 蟾蜍灵联合奥沙利铂协同诱导胃癌MGC803细胞凋亡,且可能与下调Bcl-2、上调Bax蛋白有关.     

Hedgehog-Gli 1信号通路对肝星状细胞增殖和凋亡的调控作用

目的 研究肝星状细胞(HSC)中hedgehog(Hh)信号通路成员Shh、patched、smoothened(Smo)和Gli-1的表达,及Hh通路抑制剂环耙明对HSC-T6细胞株增殖、凋亡及其激活的影响.方法 体外培养HSC株,提取细胞总RNA,用RT-PCR扩增Shh、patched、Smo、Gli-1基因;用环耙明作用HSC-T6后采用四甲基偶氮唑盐法检测其在体外对HSC-T6的抑制情况,流式细胞仪检测其对HSC-T6细胞周期的影响,碘化丙啶和膜联蛋白-Ⅴ双染荧光标记法及提取细胞DNA检测HSC-T6细胞凋亡,荧光定量聚合酶链反应检测Gli-1,转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、Bcl-2 mRNA的表达水平.结果 HSC-T6中表达有Hh通路家族成员.环耙明在50、100、150、200,250 μmol/L作用下,A值分别为1.55±0.07、1.19 ±0.05,0.78±0.06、0.48±0.03、0.38±0.04,正常对照组为1.74±0.03,环耙明组与正常对照组相比,F=636.81,P<0.01,差异有统计学意义.流式细胞术测出干预后环耙明G0/G1期细胞所占比例为65.08%±1.50%,正常对照组为55.41%±2.54%,两组比较,t=-8.05,P<0.01.药物干预后提取DNA及碘化丙啶和膜联蛋白-Ⅴ双染荧光标记均检测出HSC-T6细胞凋亡.荧光定量结果表明,经环耙明干预后,HSC-T6细胞中Gli-1、转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、Bcl-2 mRNA的目的基因相对表达量分别0.28±0.05、0.13±0.04、0.07±0.04、0.17±0.02,正常对照组为1,各基因表达量较正常对照组均明显降低,t值分别为23.09、31.34、43.87和59.10,P值均<0.01,差异有统计学意义.结论 HSC-T6中存在Hh信号通路,环耙明能抑制HSC增殖及增殖周期,促进活化的HSC凋亡,其抑制HSC活化可能是通过抑制Hh-Gli-1信号通路的结果.     

吉西他滨对人胰腺癌SW1990和BxPC3细胞株Notch信号通路的诱导作用

目的 观察吉西他滨对人胰腺癌细胞(SW1990和BxPC3)Notch信号通路活性的影响,探讨其与胰腺癌对吉西他滨化疗耐药的关系.方法 不同浓度吉西他滨处理人胰腺癌SW1990和BxPC3细胞株48 h,实时定量PCR检测Notch信号通路受体Notch1、2、3、4,配体Jagged1、2和下游靶基因Hes1 mRNA的表达,Western blotting测定细胞Hes1蛋白表达.结果 2μmol/L吉西他滨作用胰腺癌细胞株48 h,SW1990细胞的Notch1、2、3、Jagged1、2和Hes1 mRNA表达量分别为8.26±0.48、39.12±4.87、0.84±0.06、105.8±17.92、6.59±0.32和17.30±2.96,均较未处理细胞的1.02±0.15、15.25±1.28、0.12±0.02、32.66±1.98、1.88±0.29和5.02±0.64明显升高(P<0.05或P<0.01);BxPC3细胞上述各项表达量分别为7.87±0.59、109.4±10.98、0.74±0.19、62.73±13.50、2.09±0.16和15.38±1.06,也均较未处理细胞的1.14±0.43、58.96±2.63、0.10±0.02、16.95±3.79、0.98±0.02和2.04±0.16,明显升高(P<0.05或P<0.01).1、2 μmol/L吉西他滨作用胰腺癌细胞株48 h,SW1990细胞Hes1蛋白表达量分别为0.30±0.03、0.42±0.03;BxPC3细胞分别为0.33±0.02、0.45±0.03,均较未处理细胞显著增高(0.13±0.01、F=33.71;0.09±0.02、F=38.54,P值均<0.01).结论 吉西他滨可明显激活SW1990和BxPC3细胞的Notch信号通路,这可能是胰腺癌细胞获得化疗耐受性的机制之一.     

应用基因芯片研究康莱特对人胰腺癌Patu-8988细胞的凋亡诱导作用

目的 探讨康莱特注射液诱导人胰腺癌细胞(Patu-8988)凋亡过程中相关基因表达的变化。方法 通过流式细胞仪Annexin V／PI双染法研究康莱特诱导Patu-8988细胞凋亡的过程，应用基因芯片技术分析加药前后凋亡相关基因的表达差异，并以Western印迹对部分基因蛋白产物表达进行验证。结果康莱特对Patu-8988细胞的凋亡诱导作用呈时间依赖性。康莱特作用24h后，在96条有关凋亡的目的基因中共有17条基因表达发生大于3倍的显著变化，其中表达上调基因12条，下调基因5条。Western印迹表明P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白表达改变与基因芯片结果一致，同时Caspase-3底物多聚ADP核糖多聚酶被降解。结论 康莱特可使Patu-8988细胞中多个凋亡相关基因的表达发生改变，进一步揭示了其诱导胰腺癌细胞凋亡的作用机制。