hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立

目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。     

重组质粒pEGFP-N2-Wnt3a的构建和鉴定

目的构建大鼠Wnt3a真核表达重组质粒。方法从大鼠脊髓中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增编码大鼠Wnt3a的基因片段,应用基因重组技术将大鼠Wnt3a基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,经XhoI及EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得大鼠Wnt3a的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组质粒。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP-N2-Wnt3a经过鉴定,结构正确,为进一步转染骨髓基质干细胞(BMSCs)和脊髓损伤(SCI)治疗提供研究基础。     

人卵泡抑素基因短发夹RNA表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果。方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质粒载体上,构建pLKO.1-FS-shRNA重组质粒,并进行酶切和测序鉴定。确认质粒构建成功后,用脂质体(Lipofectamine TM 2000)将重组质粒瞬时转染3AO人卵巢癌细胞系,并用实时定量反转录PCR法检测重组质粒对FS基因的表达抑制效果。结果:构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致;实时定量反转录PCR结果显示pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染的3AO人卵巢癌细胞后,细胞中的FS基因转录受到抑制,抑制率达59%。结论:成功构建了靶向人FS基因的shRNA干扰靶序列重组质粒(PLKO.1-FS-shRNA),转染后对人卵巢癌细胞系FS基因的表达具抑制效果,该实验为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础。     

大鼠转化生长因子β3基因的克隆及其转染肝星状细胞后的表达

目的:克隆大鼠转化生长因子β3(TGFβ3)基因并研究其转染肝星状细胞(HSC)后的表达情况。方法:采用逆转录—聚合酶链式应(RT-PCR)从大鼠成骨细胞中扩增出特异性片段,经酶切鉴定证实为大鼠TGFβ3cDNA,将此片段插入pcDNA3.1(+)表达载体,构建得到pcDNA3.1(+)-TGFβ3重组质粒。应用阳离子脂质体介导的基因转移技术将TGFβ3表达载体导入大鼠HSC,24 h、48 h、72 h后用荧光定量PCR法进行瞬时表达的检测。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGFβ3经限制性内切酶NheI、XbaI酶切,电泳后显示的TGFβ3目的片段和5.4 kb的pcDNA3.1(+)载体片段,测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同,证实pcDNA3.1(+)-TGFβ3真核表达载体构建成功,转染48 h后,肝星状细胞的表达明显增高(P0.05)。结论:重组TGFβ3真核表达载体构建正确,并在转染大鼠HSC48 h后获得高效表达,为转基因治疗肝纤维化疾病提供理论依据。     

肾上腺髓质素基因腺病毒表达载体的构建及其对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:构建表达大鼠AM基因的重组腺病毒载体,探讨其对MSCs增殖的影响.方法:设计AM基因上下游引物,以大鼠肾脏组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得AM基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-AM.经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞.制备病毒上清并测定其滴度,并感染大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT方法评估其对MSCs增殖的影响.结果:完成构建含有AM基因的重组腺病毒,RT-PCR及Western blot检测证实AM在MSCs中表达,并能够促进其增殖(缺氧组与缺氧 AM组相比,P＜0.01).结论:构建重组腺病毒载体,并在MSCs表达AM蛋白.     

基于慢病毒介导RNA干扰技术的人PARP-1基因沉默细胞株构建

目的利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建人淋巴母细胞TK6细胞的PARP-1基因沉默细胞株,为后续PARP-1基因功能和表观遗传学调控机制的研究提供有效的工具细胞。方法利用瞬时转染方法筛选最佳干扰效果的shRNA片段,与慢病毒载体pLVX-shRNA1连接,形成重组质粒,DNA测序鉴定后进行病毒包装,转导TK6细胞,利用嘌呤霉素筛选得到稳定表达PARP-1siRNA的PARP-1沉默细胞株,并用定量PCR和Western blotting鉴定所构建的细胞株。结果转染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4细胞的PARP-1相对表达量分别为0.289、0.538、0.375和0.474,故选择shRNA1作为干扰PARP-1基因最佳片段。用0.5μg/ml的嘌呤霉素成功筛选出PARP-1沉默细胞株和空载体对照细胞株,并从mRNA、蛋白质、细胞表型来检测PARP-1基因的干扰效率,抑制效率超过80%。结论成功构建PARP-1的siRNA慢病毒干扰载体,并筛选出PARP-1基因沉默的TK6细胞株,携带shRNA的慢病毒稳定、高效干扰PARP-1基因表达。     

Effect of TIMP1 Gene in Proliferation of Human Colon Carcinoma Cells

目的 采用体外试验探讨基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因对人结肠癌(HCT-8)细胞增殖的影响.方法 构建TIMP1基因的真核表达载体和RNA干扰质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K、TIMP1 RNAi、pcDNA3.1和空白对照),将TIMP1基因真核表达质粒和RNA干扰质粒分别瞬时转染入HCT-8细胞48～72h后,采用Real TimePCR方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中基因转录表达水平,并用Western blot方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中蛋白表达水平,采用MTr试验检测TIMP1基因过表达和干扰后对HCT-8细胞增殖的影响.结果 成功构建了TIMP1真核表达质粒和RNA干扰质粒.与空白对照比较,质粒pcDNA3.1-TIMP1-K在HCT-8细胞中mRNA和蛋白的相对表达含量较高,质粒TIMP1 RNAi的mRNA和蛋白表达含量较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).构建过表达质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞的活性无显著变化(P＞0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够促进HCT-8细胞的增殖活性(P＜0.05);构建干扰质粒(TIMP1 RNAi)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞生长无显著变化(P＞0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够抑制HCT-8细胞增殖(P＜0.05).结论 TIMP1基因过表达后能够促进人结肠癌细胞的增殖,在一定条件下还能够抑制人结肠癌细胞的增殖.     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

转录因子Smad2高表达载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定大鼠转录因子Smad2的高表达载体(简称pLJM1-Smad2)。方法首先以E3大鼠肝脏cDNA为模板、PCR法获取转录因子Smad2 mRNA CDS区(即目的基因片段);然后用Age I、EcoR I双酶切pLJM1-MGFP载体和目的基因片段,用T4DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;之后再将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,扩大培养并提取重组质粒;最后用PCR、Age I和EcoR I双酶切以及DNA测序鉴定重组质粒。结果 PCR、Age I和EcoR I双酶切结果均提示pLJM1-Smad2重组载体中插入了目的片段Smad2;将含有目的片段的阳性重组体克隆送上海生工进行DNA测序,并将测序结果与NCBI数据库的进行比对,确定插入片段无突变、序列完全正确,证实pLJM1-Smad2重组载体中成功插入了目的基因片段Smad2。结论成功构建了转录因子Smad2的高表达载体pLJM1-Smad2。     

小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白基因真核表达载体的构建及其生物活性的鉴定

目的克隆小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白(CCSP)基因并构建其真核表达重组体,鉴定重组CCSP的生物学活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对CCSP基因进行扩增,Bam H I和XhoⅠ双酶切扩增产物与真核表达载体p CDNA3.1(+),酶切产物连接并转化入感受态细胞Trans 5α,阳性重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过DNAfectin 2100 DNA转染试剂将重组质粒转染人胚肾(HEK293T)细胞,采用Western blot法检测表达产物。脂多糖分别刺激转染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)质粒DNA的HEK 293T细胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以掺入大肠杆菌膜的[3H]标记的油酸为酶解底物,检测HEK 293T细胞内PLA2的活力。结果聚合酶链反应结果显示,从小鼠肺组织中扩增出约290 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP构建成功且序列正确。Western blot结果显示,在转染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T细胞中有CCSP蛋白的表达,蛋白质分子量约为10 k Da,而转染空质粒组未见表达。CCSP蛋白可以显著降低脂多糖诱导的HEK 293T细胞内PLA2的活力。结论成功构建了真核表达重组体p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重组蛋白CCSP具有生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础。     

RNAi对成牙本质细胞表达TRAF6干涉作用

目的采用针对小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的siRNA真核表达载体,探讨其对小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23中表达TRAF6的干涉作用。方法将构建成功的2个针对TRAF6基因的siRNA真核表达载体(pSUPER-T和pSUPER-2T),通过脂质体介导瞬时转染MDPC-23细胞,RT-RCR和Western blot法检测其对转染后细胞中TRAF6的mRNA和蛋白表达干涉效果。结果 pSUPER-T和pSUPER-2T转染MDPC-23细胞后,RT-RCR法显示2组TRAF6 mRNA表达下调、Western blot结果表明2组TRAF6蛋白表达水平降低,其中pSUPER-2T转染组抑制TRAF6表达作用较强。结论针对TRAF6的siRNA真核表达载体,在MDPC-23细胞中有效发挥了TRAF6表达干涉作用。     

RyR2-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对离体心肌细胞RyR2基因表达的影响

目的构建携带RyR2-shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠离体心肌细胞中RyR2的基因沉默效果。方法设计并合成针对小鼠RyR2基因的shDNA,克隆入含U6启动子和EGFP报告基因的慢病毒载体psiHIV-U6-eGFP,构建表达RyR2-shRNA的慢病毒载体,通过将慢病毒转移质粒和包装质粒共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体颗粒,然后离体感染小鼠心肌细胞,采用Real-timePCR检测RyR2在mRNA水平的沉默效应。结果经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功并成功包装。流式细胞仪测得重组慢病毒感染小鼠心肌细胞的阳性率达80%以上。Real-timePCR证实,重组慢病毒Lenti-siRyR2感染的小鼠心肌细胞中RyR2在mRNA水平基因抑制率达90%以上。结论成功构建了表达RyR2-shRNA的重组慢病毒表达载体,并在小鼠心肌细胞中实现有效的基因沉默效应。     

RNAi表达载体对卵巢癌Bcl-2基因表达的抑制作用

目的:探讨Bcl-2基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)表达载体对卵巢癌SKOV3细胞Bcl-2基因表达的抑制作用。方法:构建针对Bcl-2基因的RNAi表达载体,脂质体法转染卵巢癌SKOV3细胞株,应用RT-PCR及流式细胞仪检测其对Bcl-2基因mRNA及蛋白表达的影响。结果:构建的两种表达载体均抑制了Bcl-2基因的mRNA及蛋白的表达,其中转染2号载体的SKOV3细胞Bcl-2基因mRNA表达仅相当于对照组的32.3%,蛋白抑制率达60.18%。结论:RNAi表达载体可以有效抑制Bcl-2基因的表达。     

小发夹RNA抑制人上皮生长因子受体-2基因表达细胞株的构建

目的 在经反式二羟环氧苯并芘(BPDE)恶性转化人支气管上皮细胞基础上建立一种载体介导的小发夹RNA(shRNA)抑制人上皮生长因子受体-2(HER2/neu)表达的稳定细胞株.方法 构建靶向干扰HER2/neu shRNA逆转录病毒载体pSIREN-RetroQ-neu,经酶切及测序鉴定后,将重组表达载体经脂质体介导入反式BPDE恶性转化细胞中,同时以阴性片段重组载体转染细胞(阴性对照)和空白细胞(16HBE-T)做对照,经嘌呤霉素筛选阳性转染细胞株.半定量RT-PCR和Westernblotting技术分别检测分析各组细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白表达差异.结果 获得载体介导靶向抑制反式BPDE恶性转化细胞中HER2/neu基因表达的细胞株.pSIREN-RelroQ-neu阳性转染细胞组分别比较阴性对照和空白细胞组HER2/neu mRNA表达量均下降(平均灰度值分别为0.114±0.003、0.186±0.001、0.182±0.015),其差异有统计学意义(t值分别为39.154、7.564,P值均<0.05),而阴性与空白对照组间相比差异无统计学意义(t=-0.409,P>0.05).pSIREN-RetroQ-neu转染细胞组相比阴性对照和空白细胞组HER2/neu蛋白表达明显下降,其抑制率分别达40%和39%.结论 成功构建pSIREN-RetroQ-neu重组质粒,并能有效抑制反式BPDE恶性转化细胞中HER2/neu表达.     

siRNA表达载体对大鼠心肌H9c2细胞牛磺酸合成限速酶-CSD基因表达的抑制作用

目的研究siRNA对大鼠心肌半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)的抑制作用。方法根据已克隆的大鼠心肌CSD基因序列(EU786150)设计并构建了4个siRNAs及1个阴性对照siRNA表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒siRNA1#、siRNA2#、siRNA3#、siRNA4#及阴性对照质粒分别转染H9c2细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、四唑盐(MTT)法检测H9c2细胞增殖情况、实时荧光定量PCR和Western-blot检测CSD mRNA和蛋白表达。结果荧光显微镜观察细胞转染效率达70%左右;与阴性对照组、未转染组比较,siRNA1#重组质粒显著抑制了H9c2细胞中CSD mRNA和蛋白的表达(P<0.05),而siRNA4#质粒对CSD表达无明显抑制效应(P>0.05);MTT检测结果表明转染重组质粒siRNA1#、siRNA2#进入H9c2细胞48 h、72 h后细胞增殖明显受抑制,与阴性对照组、未转染组相比差异均达到显著水平(P<0.05)。结论 siRNA1#重组质粒能有效抑制CSD基因的表达,且显著抑制H9c2细胞增殖,为研究CSD基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础。[营养学报,2012,34(4):317-321]     

质粒介导的RNAi对神经母细胞瘤细胞Survivin基因表达的抑制作用

目的构建Survivin的短发夹RNA表达质粒并通过由其介导的RNA干扰来下调神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y细胞中Survivin的表达。方法针对人Survivin的mRNA序列设计合成两对寡核苷酸序列，退火后将其连入pBSHH1．对重组质粒pBSHH1—S1和pBSHH1-S2进行酶切和测序鉴定，然后将质粒转染SH-SY5Y细胞，运用RT—PCR和Western印迹检测Survivin基因的表达。结果酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pBSHH1，pBSHH1-S1和pBSHH1—S2转染SH—SYSY细胞后，Survivin基因的mRNA以及蛋白水平的表达量均受到明显抑制结论成功构建了人Survivin基因的短发夹RNA表达质粒，并在SH—SYSY细胞中验证了它们对Survivin基因的表达抑制作用，为神经母细胞瘤等肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

L-精氨酸转运体-2的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建氨基酸转运体-2(CAT-2)的靶向小分子干扰RNA(siRNA)表达载体质粒,并测序鉴定,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-argine/iNOS/NO通路的影响建立基础。方法:根据L-精氨酸转运体CAT-2的mRNA序列及siRNA设计原则,并经BLAST比对,设计合成4对siRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组质粒构建,将4对dsDNA分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细菌DH5。筛选阳性克隆并提取重组质粒后测序分析。结果:CAT-2的siRNA重组载体质粒测序结果证实表达载体构建成功。结论:L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体质粒成功构建,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-arg/iNOS/NO通路的影响建立基础。     

RNA干扰抑制结肠癌细胞内Bcl-2/C-Raf的表达

[目的]构建Bcl-2/C-Raf的双靶点的RNAi质粒表达载体与单靶点表达载体比较,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制作用。[方法]分别构建了针对Bcl-2、C-Raf和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofec-tamineTM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性。[结果]分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2,C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%、40.64%和63.85%。[结论]Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体。双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中具有很大优势。     

RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的 观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响.方法 构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体（pshRNA-hTERT）并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点.结果 转染乳腺癌细胞后,pshRNA - hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2% 蛋白表达分别下调46.6%,47.8%.端粒酶活性均明显下降.对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加.结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖.