慢病毒介导COX-2基因的shRNA对子宫内膜癌侵袭力的影响

目的：探讨慢病毒介导COX-2基因的shRNA对子宫内膜癌HEC-1B细胞侵袭力的影响。方法：设计、合成4对针对COX-2基因shRNA的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T细胞,据其对COX-2的抑制率,筛选最有效的COX-2基因RNAi靶序列,设计并合成其shRNA的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白（GFP）编码基因的pGCL-GFP线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-COX-2-ShRNA,并行PCR和测序鉴定。将LV-COX-2-ShRNA,pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平采用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。重组慢病毒感染人子宫内膜癌HEC-1B细胞,行RT-PCR和western-blot验证COX-2基因的沉默效果,用Transwell侵袭试验检测HEC-1B细胞体外侵袭力的改变。结果：成功构建COX-2基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×107Tu/ml。和对照组相比,RNA干扰组HEC-1B细胞COX-2基因的mRNA水平和蛋白水平的抑制率分别为61.87%和67.48%;其穿过人工基底膜的平均数为16.6,明显少于空白对照组50.2及非特异性siRNA感染组47.2,侵袭抑制率为64.8%（P〈0.01）。结论：RNA干扰可有效抑制HEC-1B细胞的侵袭能力。     

慢病毒介导COX-2基因的shRNA对子宫内膜癌侵袭力的影响

目的:探讨慢病毒介导COX-2基因的shRNA对子宫内膜癌HEC-1B细胞侵袭力的影响。方法:设计、合成4对针对COX-2基因shRNA的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T细胞,据其对COX-2的抑制率,筛选最有效的COX-2基因RNAi靶序列,设计并合成其shRNA的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL-GFP线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-COX-2-ShRNA,并行PCR和测序鉴定。将LV-COX-2-ShRNA,pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平采用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。重组慢病毒感染人子宫内膜癌HEC-1B细胞,行RT-PCR和western-blot验证COX-2基因的沉默效果,用Transwell侵袭试验检测HEC-1B细胞体外侵袭力的改变。结果:成功构建COX-2基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×107Tu/ml。和对照组相比,RNA干扰组HEC-1B细胞COX-2基因的mRNA水平和蛋白水平的抑制率分别为61.87%和67.48%;其穿过人工基底膜的平均数为16.6,明显少于空白对照组50.2及非特异性siRNA感染组47.2,侵袭抑制率为64.8%(P<0.01)。结论:RNA干扰可有效抑制HEC-1B细胞的侵袭能力。     

SET基因shRNA慢病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的： 构建SET基因shRNA慢病毒表达载体,为研究SET在三氯乙烯毒性机制中的作用提供技术支持。 方法：通过NCBI检索SET序列,设计合成5对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒共转染到293T细胞,收集病毒上清,转导入L-02肝细胞中,利用嘌呤霉素筛选得到SET缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果。结果：PCR和测序结果证明双链shRNA正确插入慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector,共转染293T细胞得到高滴度病毒,转导L-02细胞筛选出SET基因缺陷型细胞。结论：利用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了SET基因缺陷型细胞。     

胃癌细胞中TWIST慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 探讨胃癌细胞中TWIST慢病毒表达载体的构建及构建。方法 参考Genbank的人TWIST基因序列设计出1对TWIST全基因扩增引物,从人胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增TWIST基因,聚合酶链反应（PCR）产物线性化克隆入慢病毒表达载体GV341中,构建重组载体GV341-TWIST。将重组载体GV341-TWIST转染至人胃癌293T细胞包装病毒,免疫荧光检测293T细胞形态改变,蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞TWIST表达水平,实时PCR法检测病毒滴度。结果 成功构建了GV341-TWIST慢病毒表达载体,经限制性酶切后出现651 bp的条带,DNA测序分析证实重组慢病毒载体GV341-TWIST的插入序列有近100%的正确率,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测TWIST融合蛋白为25 kD。实时PCR测定重组慢病毒载体GV341-TWIST病毒滴度2.00E+8 TU/ml。结论 本实验成功构建了人重组慢病毒载体GV341-TWIST慢病毒表达载体,在人胃癌293T细胞中高效表达了TWIST蛋白。     

FAK基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建FAK基因RNA干扰慢病毒载体。方法 选定FAK基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA（引物）,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7（pLL3.7）连接,产生pLL3.7 FAK慢病毒载体, 经XbaⅠ和NotⅠ酶切电泳筛选阳性克隆,测序鉴定。用PHR、pVSVG和pLL3.7 FAK慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果 酶切和测序证实,构建出了FAK shRNA的慢病毒载体pLL3.7 FAK。包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为4×107TU/ml。结论 成功构建FAK基因RNAi慢病毒载体,为肿瘤细胞生物学行为及功能研究提供了一个有用的工具。     

CRKL基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CBKL基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 将筛选确定的CRKL基因RNAi有效靶序列克隆到pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shCRKL慢病毒载体.通过酶切、测序验证后,用LV-shCRKL、pHelper 1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 载体片段插入正确.共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒LV-shCRKL.结论 成功构建了人CRKL基因RNAi病毒载体.     

靶向Rap1b基因shRNA慢病毒载体的构建及其对食管鳞癌细胞Rap1b基因表达的沉默

目的:设计以Rap1b基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒表达载体并转染食管鳞癌细胞,观察其在食管鳞癌细胞中的表达。方法:应用重组DNA 技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA1/2/3/4。并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）及Western blot分别从mRNA 和蛋白水平检测转染食管鳞癌细胞株Eca109后Rap1b基因的表达情况。结果:测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×10⁹TU/ml,pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA3/4转染后72h和96h均可显著抑制Rap1b基因mRNA及蛋白的表达。结论:成功构建Rap1b基因的shRNA 慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制食管鳞癌细胞Eca109中Rap1b基因的表达。     

RNA干扰Nodal基因对胃癌细胞凋亡及血管生成的影响

目的构建并鉴定Nodal基因的RNA慢病毒表达载体,探讨Nodal基因对胃癌及血管生成的作用。方法针对Nodal mRNA设计siRNA,构建慢病毒质粒,测序鉴定质粒构建成功。将构建的慢病毒质粒及包装质粒共转染293T细胞,鉴定慢病毒包装成功,并测定其滴度。将慢病毒转染人胃腺癌细胞株MKN-45,通过qPCR检测Nodal基因表达。流式细胞仪检测细胞凋亡。Cellomics仪观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管生成。结果通过测序显示,插入Nodal基因RNAi序列正确。包装后测定病毒滴度达(5.0×10~8)TU/ml,qPCR检测提示RNA干扰病毒转染MKN-45细胞株后,Nodal基因表达水平显著下降。干扰后胃癌细胞凋亡率明显上升(P<0.05),干扰Nodal基因对血管生成无显著影响(P>0.05)。结论成功构建了人Nodal基因的RNAi慢病毒表达系统。干扰Nodal基因显著增加胃癌细胞凋亡。     

携带靶向沉默LSD1基因表达shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建慢病毒干扰LSD1表达的载体并鉴定。方法:设计并合成3对针对LSD1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒连接,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人胃癌MKN-28细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过real time-PCR法检测细胞中LSD1基因的表达水平。结果:经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒构建成功;转染胃癌MKN-28细胞后,LSD1基因在mRNA水平的表达降低。结论:成功构建了靶向LSD1基因的shRNA慢病毒载体,并筛选出1种对LSD1基因有显著抑制作用的shRNA。     

CYP2E1基因RNA干扰载体的构建与表达

目的：构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持。方法：通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLK0．1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Westernblot鉴定干扰效果。结果：PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLK0．1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1基因沉默细胞,荧光定量PCR检shRNA3的最高抑制效率为86．9％,Westernblot鉴定shRNA3基本无CYP2E1表达。结论：利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。     

CXCR4基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建人CXCR4基因RNAi（RNA interference,RNAi）慢病毒载体。方法：针对筛选确定的人CXCR4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL—GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果：PCR鉴定与DNA测序证实合成的含CXCR4 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论：成功构建人CXCR4基因RNAi慢病毒载体。     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞VIM基因的表达

Objective: To construct a lentiviral expression vector for RNA interference (RNAi) of human VIM gene; and assess its gene silencing effect in pancreatic cancer cell line Panc-1. Methods: Three pairs of human VIM gene short hairpin RNA (shRNA) sequences were designed using a software available on-line and one pair came from document. After synthesis and annealing, four double-stranded oligonucleotides (dsOligo) were cloned into the pGCL-GFP/U6 plasmid, which were subsequently confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing analysis. Real-time PCR and Western blotting were used to screen the effective pGCL-GFP-shRNA plasmid in 293T cells, then the most effective one was packed into the recombinant lentivirus Lv-VIM-shRNA with lentiviral packing materials pHelper 1.0 and pHelper 2.0 in 293T cells.The titer of lentivirus was determined by hole-by-dilution titer assay. The silencing effect of Lv-VIM-shRNA in Panc-1 cells were validated by real-time PCR and Western-blotting. Results: An effective Lv-VIM-shRNA was successfully constructed.The titer of lentivirus was determined on 2×109TU/mL. The expressions of VIM mRNA and vimentin were down-regluated in the Panc-1 cells infected with Lv-VIM-shRNA. Conclusion: An effective Lv-VIM-shRNA could inhibit the expression of VIM gene in Panc-1 cells in vitro, which provides a tool for investigating the role of VIM gene in the signaling pathway involved in tumorigenesis and progression of pancreatic cancer and searching new therapeutic targets.     

慢病毒介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达

目的：探讨慢病毒系统介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的过表达,为进一步研究LKB1基因在子宫内膜癌的作用机制奠定基础。方法以PCR扩增LKB1克隆质粒获得全长cDNA,将LKB1 cDNA链接到慢病毒载体pWPI,构建慢病毒表达质粒LKB1/pWPI。通过与包装质粒pCMV-Dr8.74和pMD2.G共转染293T细胞进行病毒包装,用包装成功后的病毒液感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,以荧光定量PCR、Western blot法检测HEC-1A细胞中LKB1的相对表达量。结果成功扩增LKB1全长cDNA和构建LKB1重组慢病毒表达载体LKB1/pWPI。转染包装293T细胞后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞HEC-1A。转染后HEC-1A-LKB1-pWPI细胞中LKB1的表达率明显高于亲本细胞和空白对照细胞（P〈0.01）。结论成功构建携带LKB1基因的慢病毒表达载体,包装病毒后能有效地感染子宫内膜癌HEC-1A细胞,为进一步探讨LKB1基因在子宫内膜癌中的生物学效应奠定了基础。     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

一种基于人 miR -30结构高效干扰 LMP1基因表达的慢病毒载体的构建

目的：构建慢病毒载体并利用 miRNA 原理进行 LMP1病毒癌基因干扰的可行性及有效性研究。方法：基于人 miR -30a 结构,利用靶点分析软件设计4个 LMP1的候选干扰靶点,报告基因 EGFP 与 miR -LMP1靶点形成共顺反子表达,靶点载体质粒与 LMP1高表达质粒用脂质体共转染工具细胞293FT,用 West-ern blot 方法筛选最有效的干扰靶点并用三质粒系统在293FT 细胞中包装慢病毒,进行滴度鉴定。结果：在293FT 工具细胞中成功筛选到一个高效干扰 LMP1基因的靶点序列,在 Western blot 水平的蛋白干扰率高达95%;在20ml 培养上清中可获得具有活性慢病毒颗粒7.2×10^8个,经纯化浓缩获得重组慢病毒颗粒,滴度高达6×10^9 TU/ ml,经流式细胞仪检测在80MOI 时其感染 EBV 阳性的鼻咽癌细胞株 C666-1的感染率高达80%以上。结论：基于人 miR -30a 结构的 miR - LMP1能高效干扰 LMP1基因的蛋白表达,利用慢病毒载体来建立稳定基因干扰肿瘤细胞株可能是一个良好的方法。