重组pEGFP-Mfn2真核表达载体的构建及转染人乳腺癌细胞系MCF-7

目的:构建Mfn2基因真核表达载体,将此载体转染入人乳腺癌细胞系MCF-7,并观察高表达Mfn2对MCF-7增殖的影响.方法:1)设计pEGFP-Mfn2质粒,并将其用脂质体转染入人乳腺癌细胞系MCF-7; 2)DNA测序、RT-PCR法、流式细胞术及免疫细胞化学法鉴定以上述载体是否转染成功;3)MTT法检测转染后Mfn2对MCF-7细胞增殖的影响.结果:1)重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入小鼠Mfn2的全长编码基因,DNA序列测定的结果与预期设计基本一致.普通PCR琼脂糖凝胶电泳显示转染后MCF-7细胞中存在外源性Mfn2的表达.2)琼脂糖凝胶电泳检测显示实验组中Mfn2较对照组明显升高,转染Mfn2后MTT法检测转染pEGFP-Mfn2组的MCF-7细胞数明显低于空白对照组与转染pEGFP-N1组,P＜0.05.3)细胞免疫化学显示转染Mfn2后MCF-7细胞数目减少,癌细胞出现核碎裂现象.结论:成功构建了Mfn2基因真核表达载体,并成功转染MCF-7细胞.转染Mfn2后,MCF-7细胞的增殖受到明显抑制.     

VEGF-C短发夹RNA抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的实验研究

目的探讨应用靶向VEGF—C的短发夹RNA（shRNA）质粒载体在体外抑制乳腺癌细胞株MCF-7生物学活性的影响。方法制备携带有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的VEGF—C—shRNA质粒载体，脂质体转染方法转入乳腺癌细胞株MCF-7，通过倒置荧光显微镜及流式细胞术检测细胞的转染效率，RT—PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF—CmRNA及蛋白的表达变化，MTT法检测细胞增殖抑制率，重组基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果高效转染入VEGF—C—shRNA的MCF-7细胞VEGF—C mRNA及蛋白表达水平显著下降；VEGF—C ShRNA对MCF-7细胞具有明显的增殖抑制作用，其抑增殖效应呈时间依赖性；VEGF—C—shRNA可抑制乳腺癌细胞MCF-7体外侵袭重组基底膜的能力，与阴性shRNA转染组、空载体组及空白组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；结论VEGF-C在乳腺癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用，通过RNA干扰技术实现VEGF—C沉默在乳腺癌的基因治疗中具有可行性。     

FRNK抑制人乳腺癌细胞体外增殖及机制研究

目的：研究黏着斑相关非激酶（focal adhesion kinase related non—kinase，FRNK）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用及相关机制。方法：通过RT—PCR方法克隆目的基因FRNK，构建pcDNA3．1-FRNK重组质粒；经脂质体分别介导重组质粒（pcDNA3．1-FRNK）、阳性对照质粒（pcDNA3．1-GFP）和空质粒（pcDNA3．1）转染MCF-7细胞，以正常MCF-7细胞作为空白对照；通过检测转染后细胞FRNK蛋白的表达，并结合转染pcDNA3．1-GFP后细胞表达荧光的多寡来评估转染效率；采用MTT法研究转染后12、24、48和72h各时间点细胞的增殖情况；转染质粒48h后，采用流式细胞术分析MCF-7细胞周期，Westernblot法检测细胞核内NF-κBp65的表达。结果：pcDNA3．1-FRNK质粒可经脂质体介导高效转染MCF-7细胞，促进细胞FRNK的表达，FRNK表达量在转染后48h达高峰；转染pcDNA3．1-FRNK后，MCF-7细胞增殖趋缓，且这种抑制增殖呈一定的时间依赖性；转染FRNK基因后，S＋G2／M期的细胞比例较正常细胞显著下降（P〈0．05）；转染pcDNA3．1-FRNK后MCF-7细胞核内NF-teBp65蛋白表达减少。结论：FRNK可抑制MCF-7细胞增殖，其抑制作用与下调NF-κBp65核易位相关。     

基因转染LL-37/hCAP-18对人乳腺癌细胞凋亡的影响

目的：探讨基因转染人源抗菌肽LL-37/hCAP-18对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡的影响。方法：将含人LL-37/hCAP-18的真核表达质粒瞬时转染人MCF-7细胞,48h后,MTT比色检测MCF-7细胞的增殖,流式细胞术检测MCF-7细胞周期及凋亡,细胞免疫组化染色检测MCF-7细胞中Bax、Bcl-2的表达。结果：重组基因瞬时转染MCF-7细胞48h后,与各对照组相比,肿瘤细胞的生长增殖受到显著抑制（P〈0.05）;转染重组基因组肿瘤细胞凋亡率显著高于各对照组（P〈0.05）,但细胞周期无明显变化;与对照组相比,转染重组基因pEGFP-c1-LL-37的MCF-7细胞中Bcl-2表达显著下降（P〈0.05）,Bax由阴性表达转为表达明显升高。结论：LL-37/hCAP-18可以通过上调促凋亡因子Bax、下调抗凋亡因子Bcl-2诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖。     

短发夹RNA沉默S100A4基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响

目的:观察靶向S100A4基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭的抑制作用.方法:构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,经过脂质体介导将S100A4-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞.应用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平,运用MTT法和FCM法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平和凋亡率变化.转染细胞经G418筛选及克隆化培养后获得稳定转染株, 运用Transwell小室法和划痕实验检测其侵袭力和迁移力的变化,裸鼠体内成瘤实验检测体内细胞增殖情况.结果: 经测序鉴定证实成功构建了S100A4-shRNA表达载体.所构建的S100A4-shRNA表达载体转染MCF-7细胞48 h后,能有效抑制S100A4的表达,并且显著降低MCF-7细胞增殖水平,以及诱导细胞进入晚期凋亡.稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,但其侵袭力和迁移力明显下降;裸鼠体内成瘤实验也显示实验组裸鼠移植瘤的体积和质量明显小于空白对照组和阴性对照组. 结论:S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平以及细胞侵袭力和迁移力.     

LINC01936在乳腺癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭特性的影响

摘 要：［目的］ 研究LINC01936在乳腺癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。［方法］ 从UCSC XENA数据库中获取LINC01936在1 099例乳腺癌组织和292例非配对癌旁组织及112例配对样本中的表达数据。用LINC01936-pcDNA3.1或pcDNA3.1质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞,获得过表达LINC01936的MCF-7细胞和对照 MCF-7细胞。使用cell counting kit-8(CCK-8) 细胞增殖实验测定LINC01936对MCF-7细胞增殖的影响。采用Transwell实验和细胞划痕实验测定细胞迁移和侵袭能力。通过细胞黏附实验检测黏附能力。荧光Hoechst33342染色法用于评价LINC01936对细胞凋亡的影响。Western blot和免疫荧光法用于检测NF-κB的蛋白水平。［结果］ 生物信息学分析表明,LINC01936在乳腺癌组织中低表达。CCK-8检测显示,LINC01936抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05）。Transwell实验及细胞划痕实验表明,转染LINC01936过表达质粒后,MCF-7细胞迁移和侵袭能力下降。细胞黏附实验表明,LINC01936减弱乳腺癌细胞的黏附能力（P<0.05）。荧光染色分析表明,LINC01936过表达促进MCF-7细胞的凋亡。Western blot和免疫荧光显示,LINC01936促进NF-κB的表达。［结论］ LINC01936可能通过促进NF-κB的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。     

PIN1 反义核酸对乳腺癌MCF-7 细胞增殖及周期的影响

 目的 本研究利用PIN1反义核酸阻断乳腺癌MCF-7细胞中PIN1表达，观察其对增殖及周期的影响。方法 构建PIN1反义核酸真核表达质粒pPINlas，用脂质体转染法将重组质粒转染MCF-7细胞，G418筛选稳定表达重组质粒的克隆，RT-PCR检测PIN1基因表达水平，Western blot检测PIN1蛋白的表达，MTT检测细胞增殖状况，流式细胞术检测细胞周期。结果 稳定表达PIN1反义核酸的MCF-7细胞内PIN1基因表达在mRNA水平和蛋白水平都显著降低；MTT实验显示MCF-7PINas细胞的增殖速度较MCF-7细胞明显减慢（P〈0．05），但FCM显示MCF-7PINas细胞和MCF-7细胞的周期分布差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 阻断PIN1可以显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性，提示PIN1可能成为乳腺癌基因治疗的新的靶点。     

FBXW7过表达可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡

目的:探讨F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW 7)基因过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响。方法:构建FBXW 7过表达的重组载体pEZ-M02-FBXW7质粒,并将其转染乳腺癌MCF-7细胞,应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测pEZ-M02-FBXW7转染后MCF-7细胞中FBXW7 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和Transwell法检测细胞增殖、迁移和侵袭情况,FCM法检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:pEZ-M02-FBXW7转染后,乳腺癌MCF-7细胞中FBXW7 mRNA和蛋白的表达水平高于阴性对照组(将空载体pEZ-M02质粒转染至MCF-7细胞)和空白对照组(未进行转染的MCF-7细胞)(P值均<0.01),MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显下降(P值均<0.05),MCF-7细胞被阻滞于G0/G1期(P<0.05),且细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论:FBXW7高表达可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭和迁移,并可促进细胞凋亡。     

RNA干扰抑制Dicer对人乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的:观察应用RNA干扰(RNAi)技术抑制Dicer基因,对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特征的影响。方法:选取人乳腺癌MCF-7细胞株,应用脂质体法转染Dicer siRNA序列,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot方法检测转染后Dicer基因的表达。应用MTT法和Transwell方法评价人乳腺癌细胞Dicer基因抑制前后生物学行为的变化。结果:RNAi可显著抑制MCF-7细胞Dicer基因的表达;和对照组比较,转染siRNA实验组Dicer mRNA水平在转染后24、48、72h明显降低(分别为0.00152、0.00063、0.00096,P＜0.01),且在转染后48h降低最明显,并且Dicer蛋白水平在转染后48h也明显降低(2.581±0.028,P＜0.01)。转染siRNA序列组的MTT吸光度值在转染后明显增高,Transwell穿膜细胞数在转染后48h也明显增多。结论:抑制Dicer基因在人乳腺癌细胞中表达后,人乳腺癌细胞增殖能力和细胞迁移能力明显增强。     

MSTI基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的影响

目的：探讨MST1（mammalian sterile 20-like kinase1）基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的影响。方法：构建含有标签蛋白FLAG的MSTI质粒pCMV-FLAG-MST1；将构建好的pCMV-FLAG-MST1质粒在脂质体lipofectamine2000的介导下转染MCF-7细胞，通过Western印迹法分析MST1在MCF-7中的表达情况；分别在转染后12、24、36和48h通过MTF法观察MST1对细胞增殖的影响；转染后36h加入5-溴-2’脱氧尿嘧啶（bromodeoxy uridine，BrdU），通过其掺入比率显示MST1对细胞增殖的影响；转染后36h加入顺铂，作用14h后通过AnnexinV检测其对细胞凋亡的影响。结果：成功构建pCMV—FLAG-MST1质粒；MTT及BrdU检测显示，转染pCMV—FLAG-MST1质粒后MCF-7细胞增殖明显受到抑制；AnnexinV检测结果提示，高表达MST1后，细胞的凋亡率相对增高。结论：在乳腺癌细胞MCF-7中高表达MST1，不仅可以抑制细胞增殖，还可以促进细胞凋亡。     

IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响

目的 构建真核表达载体pIRES-IL-24-TRAIL,探讨其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响。方法 以人胎盘组织总RNA为模板,采用RT-PCR二步法,扩增TRAIL的cDNA序列,将其克隆入pIRES载体,扩增IL-24的cDNA序列,将其克隆入pIRES- TRAIL载体,构建重组真核表达载体pIRESIL-24- TRAIL,以Lipofectamine2000转染技术,将质粒pIRES- IL-24-TRAIL导入乳腺癌干细胞MCF-7和MDA-MB-231,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,划痕实验比较不同组间细胞迁移情况。结果（1）克隆到TRAIL、IL-24基因的cDNA序列,成功构建其真核表达载体。（2）流式细胞仪发现,实验组比对照组细胞凋亡率高(P<0.05)。（3）细胞划痕实验显示实验组细胞迁移能力明显低于对照组（P＜0.05）。结论 pIRES-IL-24-TRAIL构建成功,并能诱导乳腺癌干细胞凋亡、降低其迁移能力。     

过表达PNRC对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响

目的：探讨核受体辅活化子（coactivator）PNRC（proline—rich nuclear receptor coregulatory protein）对乳腺癌细胞生长的影响。方法：以pACT2／PNRC为模板，采用PCR扩增全长PNRC编码序列，将BclⅠ和XhoⅠ消化的PCR产物插入pCMVtaq2c，构建pCMVtaq2c／PNRC真核表达质粒。酶切和测序鉴定后，采用脂质体转染法，分别将pCMVtaq2c／PNRC表达质粒和pCMVtaq2c空质粒转染MCF-7细胞，经G418筛选4周后，分别采用RT—PCR、Northern blot和Western Blot鉴定稳定表达PNRC的MCF-7细胞株。最后，采用MTT法和^3H-胸腺嘧啶掺入法观察了过表达PNRC的MCF-7乳腺癌细胞和pCMVtaq2c空质粒转染的MCF-7乳腺癌细胞生长速率和增殖的差异。结果：成功构建了PNRC的真核表达质粒pCMVtaq2c／PNRC，并筛选到稳定表达PNRC的MCF-7乳腺癌细胞株，转染PNRC的MCF-7细胞的生长速率和增殖明显慢于对照组细胞。结论：过表达的PNRC对MCF-7乳腺癌细胞的生长具有抑制作用。     

蝙蝠葛碱在人乳腺癌MCF-7细胞对5氟尿嘧啶敏感性的研究

目的 探讨人乳腺癌MCF-7细胞受蝙蝠葛碱(Dauricine,Dau)作用后,对5氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影响。方法 分别以终浓度为2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱、50 μg/mL的5-FU、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU作用于人乳腺癌细胞MCF-7,运用MTT法检测细胞增殖活性,Transwell实验分析细胞的迁移,DAPI染色检测细胞的凋亡,Western blot法检测cyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结果 MTT实验结果显示联合使用阈下浓度的蝙蝠葛碱增强了5-FU对细胞增殖的抑制;Transwell实验表明联合应用阈下浓度的蝙蝠葛碱进一步加剧了5-FU对细胞迁移的抑制;DAPI染色说明联合应用阈下剂量的蝙蝠葛碱加强了5-FU对细胞凋亡的诱导,Western blot实验表明联合应用阈下浓度的蝙蝠葛碱进一步抑制了cyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结论 蝙蝠葛碱可有效增强人乳腺癌MCF-7细胞对5-FU的敏感性。     

Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用

目的 探讨Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用。方法 利用脂质体将真核表达载体pIRES2-EGFP-Noxa瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞,通过RT-PCR检测转染后Noxa基因mRNA的表达,Western blot检测转染后蛋白的表达,MTT 比色法测定细胞增殖的抑制,流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡情况。结果 Noxa基因转染后在乳腺癌MCF-7细胞中成功表达。转染后mRNA及蛋白表达持续上升,其转染后24h、48h、72h mRNA的相对灰度值分别为(0.347±0.031)、(0.703±0.041)、(1.044±0.033),差异具有统计学意义（P<0.05）。转染24h、48h、72h后蛋白表达的相对灰度值为(1.171±0.086)、(1.013±0.088)、(0.886±0.063),差异具有统计学意义（P<0.05）。Noxa基因的表达使得乳腺癌MCF-7细胞出现增殖抑制,其24h、48h、72h抑制率分别为（23.9±4.2）%、（36.6±3.0）%、（47.0±3.3）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测显示MCF 7细胞DNA合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G0/G1 期。其转染24h、48h、72h的G0/G1期分别为（68.1±2.5）%、（72.6±1.5）%、（75.6±0.9）%,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）;其24h、48h、72h凋亡率分别为（11.5±0.9）%、（19.6±0.8）%、（25.4±0.7）%,组间差异有统计学意义（P<0.05）。Hoechst 33342染色显示Noxa基因转染后细胞出现凋亡,其24h、48h、72h凋亡率分别为（7.3±4.1）%、（16.8±3.3）%、（23.8±2.3）%,与阴性对照组相比,其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞后能够抑制细胞增殖并促进其凋亡。     

miR-21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨人微小RNA-21（miR-21）重组表达质粒对人胃癌SGC-7901细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。方法设计合成靶向miR-21的互补双链DNA,退火后与真核表达载体pPG—miR．EGFP克隆连接,构建pPG—miR-21-EGFP重组表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将鉴定正确的重组表达质粒pPG—miR-21．EGFP转染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察转染效率。实验分为3组：空白对照组、空载体组、重组表达质粒组。以RT—PCR检测转染前后胃癌细胞miR-21的表达水平。MTY法评价重组表达质粒抑制肿瘤细胞生长的效果,流式细胞术及Hoechst33258法检测转染后胃癌SGC-7901细胞周期的分布和凋亡。Westernblot法、免疫细胞化学法分别检测转染前后PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclinD1蛋白表达的水平。结果酶切及测序鉴定证实成功构建重组质粒pPG—miR-21-EGFP,转染人胃癌SGC-7901细胞后,荧光显微镜下观察转染效率达75％。RT—PCR检测显示重组表达质粒组胃癌细胞miR-21的表达下调,与空白对照组和空载体组比较,差异具有统计学意义（P〈O．05）。Westernblot法、免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌细胞cyclinD1、PCNA、bcl-2蛋白的表达下调（P〈0．05）,而PDCD4、PTEN蛋白的表达上调（尸〈0．05）。重组表达质粒组的细胞生长缓慢,凋亡指数增加。流式细胞术检测结果显示重组表达质粒组G。期细胞的百分比较空白对照组增加[（69．71±0．314）％（50．1~0．331）％],S期细胞较空白对照组明显减少[（14．68~0．448）％口s（28．47~0．316）％]（P〈0．05）。结论重组表达质粒pPG．miR．21-EGFP可显著下调miR-21在胃癌SGC-7901细胞中的表达,并在-定程度上抑制胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,使较多的细胞停留在G。期,s期细胞减少,其作用机制可能是通过下调cyclinD1、PCNA、bcl．2蛋白的表达,上调PDCD4、PTEN蛋白的表达而实现的。     

pVAX-iNOS真核表达载体的构建及其抗肺癌作用研究

背景与目的 iNOS与NO介导的抗肿瘤效应有关.本研究旨在构建pVAX-iNOS载体并转染A549肺癌细胞,检测其基因的表达并初步探讨iNOS基因表达增高后对A549肺癌细胞的抗肿瘤作用.方法 应用RT-PCR方法扩增人iNOS编码序列的CDS片段,构建pVAX-iNOS载体后转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达;采用MTT法、Hoechst 3235染色和划痕实验分别检测iNOS高表达在体外对肺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移作用的影响.结果 真核表达质粒载体pVAX-iNOS构建成功,iNOS蛋白在转染后的A549细胞中表达升高.pVAX-iNOS转染A549肺癌细胞后能明显诱导细胞发生凋亡并抑制肿瘤细胞的生长和迁移.结论 本研究成功构建pVAX-iNOS真核表达质粒,高表达iNOS能明显抑制A549细胞的增殖、迁移并促进细胞发生凋亡.本研究有望为临床治疗肺癌提供一个新的有效策略.     

人源FOXG1基因真核表达载体的构建、表达及其对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:构建人源FOXG1真核表达载体,瞬时转染HeLa细胞实现FOXG1过表达,观察FOXG1对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,为后续研究人源FOXG1基因在肿瘤中的作用机制奠定理论基础。方法:利用One Step Cloning法构建重组质粒pEGFP-C1-FOXG1,并通过酶切、测序对重组质粒进行鉴定;采用脂质体介导的转染法将pEGFP-C1-FOXG1瞬时转染至HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测HeLa细胞中EGFP-FOXG1融合蛋白的表达;进一步,分别通过CCK8、伤口愈合和Transwell实验检测FOXG1对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:酶切鉴定和测序表明重组质粒pEGFP-C1-FOXG1构建成功;瞬时转染HeLa细胞24小时后,能够在荧光显微镜观察到绿色荧光,48小时后转染效率达到90%;Western blot显示EGFP-FOXG1融合蛋白正确表达;CCK8实验表明过表达FOXG1能够促进HeLa细胞的增殖;伤口愈合和Transwell实验表明FOXG1过表达可以促进HeLa细胞的迁移和侵袭。结论:成功构建了pEGFP-C1-FOXG1重组质粒,并在HeLa细胞中正确表达;功能实验表明FOXG1能够促进HeLa细胞增殖、迁移和侵袭。     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

pcDNA3.1-CD74-ROS1重组质粒构建与表达对肺癌细胞增殖及迁移的影响

目的 构建C-ros致癌基因1（ROS1）融合基因CD74-ROS1重组质粒,并转染A549细胞株,检测其对肺癌细胞迁移能力的影响。方法 通过PCR技术获得CD74和ROS1基因片段,利用融合PCR法构建CD74-ROS1融合基因,构建pcDNA3.1-CD74-ROS1重组质粒,通过脂质体转染技术转入A549细胞中,利用Real-time PCR和Western blot技术检测CD74-ROS1的表达。MTT法观察细胞增殖情况,结晶紫染色法观察细胞形态变化,划痕实验检测CD74-ROS1对肺癌细胞迁移能力的影响。结果 酶切及测序结果表明CD74-ROS1融合基因构建成功,阳性克隆的CD74-ROS1蛋白表达显著增加。CD74-ROS1过表达导致细胞增殖能力增强,细胞形态上发生上皮-间质样转变且细胞迁移能力增强。结论 pcDNA3.1-CD74-ROS1重组质粒构建成功,并在A549细胞中稳定表达,CD74-ROS1过表达能够促进肺癌细胞增殖、形态转变且增强其迁移能力。     

Effects of SASH1 on lung cancer cell proliferation, apoptosis, and invasion in vitro

The purposes of this study were to investigate the effects of the SASH1gene on the growth, proliferation, apoptosis, invasiveness, and metastatic potential of lung cancer cells and explore the potential use of SASH1 for the treatment of human lung cancer. The SASH1 gene was cloned into the pcDNA3.1 eukaryotic expression vector, and SASH1 shRNA were designed and constructed. The resulting constructs were transfected into A549 human lung cancer cells, and the changes in the relevant biological characteristics of the cells overexpressing SASH1 and cells with downregulated expression of SASH1 were analyzed using the MTT assay, transwell invasion assay, and flow cytometry. The effects of the SASH1 gene on the expression of cyclin D1, Bcl-2, and MMP-2/9 were also concurrently examined. In the A549 cells from the pcDNA3.1-SASH1 transfected group, cell viability, proliferation, and migration were significantly reduced compared to the control cells (p?=?0.039, p?=?0.013), and a cell cycle arrest in G1 was observed. The A549 cells transfected with the SASH1 shRNA demonstrated significantly higher cell viabilities, proliferation, and migration compared to the control cells (p?=?0.012, p?=?0.045). Additionally, the percentage of A549 cells undergoing apoptosis was significantly higher in the pcDNA3.1-SASH1 transfected cells and significantly lower in the SASH1 shRNA transfected cells compared to the control cells (p?=?0.010, p?=?0.000). The cyclin D1, Bcl-2, and MMP-9/2 protein expression levels were significantly lower in the pcDNA3.1-SASH1-transfected cells and were significantly higher in the SASH1 shRNA-transfected cells than that in the control cells. The SASH1 gene may inhibit A549 cell growth and proliferation as well as promote cellular apoptosis. The overexpression of the SASH1 gene may also be related to the decreased migration of A549 human lung cancer cells.