洛伐他汀和 BRCA1基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞周期的影响

背景与目的：人乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1是一个抑癌基因,其编码产物能以细胞周期依赖的方式在细胞中表达,其突变增加了患乳腺癌和卵巢癌的危险。洛伐他汀(lovastatin,LOV)是胆固醇合成的限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原抑制剂。本研究探讨BRCA1基因与LOV合用对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及其作用机理。方法：运用脂质体转染法将含有BRCA1基因的表达载体转染MCF-7细胞;RT-PCR和Western blot鉴定转染后BRCA1的表达。MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期相分布,Western blot检测Cyclin D1、Rb蛋白的表达。结果：转染pcDNA3-beta-HA-hsBRCA1的MCF-7细胞能稳定生长。台盼蓝染色结果显示,经LOV处理4天后MCF-7细胞生长受到抑制,MCF-7^BRCA1细胞抑制更显著。与MTT法的结果相类似。流式细胞仪分析表明,LOV处理后,G0／G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,随处理时间的延长,G0／G1期细胞进一步增加,且MCF-7^BRCA1细胞比MCF-7细胞变化更明显。Western blot结果显示,LOV处理48h和72h后,Cyclin D1、Rb蛋白表达水平均下凋,尤其是MCF-7BR^BRCA1细胞下凋更明显。结论：转染BRCA1基因能提高MCF-7细胞对洛伐他汀的敏感性,进而增强洛伐他汀的抗肿瘤作用。     

Hsa-miR-133b影响人乳腺癌MCF-7细胞增殖及FSCN1蛋白表达的研究

目的:研究Has-miR-133b真核表达载体在人乳腺癌MCF-7细胞中的表达及对细胞增殖和对靶蛋白FSCN1表达的影响。方法:构建pEZX MR04-133b真核表达载体,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,RT-PCR法检测miRNA-133b在转录水平的表达,MTT检测其对细胞增殖的影响。利用生物信息学的方法,根据Tarbase数据库预测miR-133b的靶基因,并进行基因功能初步分析。Western blot检测miR-133b对细胞中FSCN1蛋白表达情况的影响。结果:真核表达载体pEZX MR04-133b成功转染MCF-7细胞,并经RT-PCR检测可有效表达,MTT结果显示miR-133b能明显降低MCF-7细胞的相对增殖率。Western blot结果显示FSCN1为miR-133b在MCF-7细胞中的作用靶点之一。结论:构建了真核表达载体pEZX MR04-133b,转染乳腺癌MCF-7细胞后能有效表达,并以FSCN1基因作为作用靶点。     

Pannexin1通道对乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖和侵袭迁移的影响及可能机制

摘 要：［目的］ 探究Pannexin1对乳腺癌细胞MCF-7增殖、侵袭迁移的影响及可能机制。［方法］ MTT法检测0、12.5、25、50、100、200μmol/L甘珀酸（CBX）对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响;集落克隆检测CBX对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响;采用实时荧光法检测细胞间荧光传递能力;化学发光法检测细胞外ATP浓度。使用100μmol/LCBX处理乳腺癌细胞MCF-7后,Transwell法检测MCF-7细胞的侵袭迁移能力;Western 印迹法检测乳腺癌细胞中相关蛋白p-ERK1/2、ERK1/2、Vimentin、MMP-9蛋白的表达。［结果］ MTT实验结果表明,200μmol/L CBX可显著性抑制MCF-7细胞增殖能力（P<0.05）,而100μmol/L CBX对MCF-7细胞增殖能力无显著性抑制作用（P>0.05）。集落克隆实验结果表明,200 μmol/L CBX可显著性抑制MCF-7细胞增殖能力（P<0.05）。实时荧光法和化学发光法实验结果表明,100μmol/L和200μmol/L CBX显著性抑制Pannexin1通道功能（P<0.05）;Transwell实验和划痕实验结果表明,100μmol/L CBX显著性抑制乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力（P<0.05）;Western印迹法结果表明,CBX抑制Pannexin1后,乳腺癌细胞MCF-7中ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-9和Vimentin蛋白表达量下降（P<0.05）。［结论］ 200μmol/L CBX抑制Pannexin1通道后,乳腺癌MCF-7细胞活性和增殖能力减弱,而100μmol/L CBX可降低乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力,其机制可能与ERK1/2表达量下降有关。     

REGgamma基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

目的:探讨蛋白酶体激活因子REGgamma(REGγ)基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的作用.方法:构建真核表达重组体PcDNA3.1-REGγ,通过脂质体转染将REGγ基因导入MCF-7,以G418(800mg/L)连续筛选获得稳定高表达REGγ基因的细胞株,以转染空载体和未转染细胞作为对照.分别利用MTT法及免疫细胞化学方法检测各组细胞PCNA的表达分析REGγ基因对细胞增殖的影响;以Caspase-3分光光度法及AnnexinV-FITC的流式细胞仪(FCM)来检测细胞凋亡的变化;以透射电镜(TEM)观察细胞超微结构的改变.结果:获得稳定转染且高表达REGγ的细胞株.经Western Blot检测转染REGγ基因的细胞(实验组),其REGγ蛋白表达明显高于对照组细胞(P＜0.05);未转染组、空载体组和实验组细胞的倍增时间分别为34.6、35.1、26.7h.提示实验组细胞倍增时间缩短;MTT法绘制生长曲线提示实验组细胞生长明显加速;免疫细胞化学检测PCNA结果显示,未转染组、空载体组和实验组细胞的染色灰度值分别为89.61±14.32、87.95±16.38、133.47±8.14,表明实验组细胞PCNA表达明显增强(P＜0.01);Caspase-3分光光度法检测显示,实验组细胞的OD值普遍低于对照组(P＜0.05);Annexin V-FITC的FCM检测显示,实验组细胞的凋亡率明显低于对照组(P＜0.01);TEM观察实验组细胞表现为核仁肥大,线粒体、高尔基体丰富或扩张,未见凋亡小体形成.结论:REGγ基因具有促进乳腺癌MCF-7细胞增殖并抑制其凋亡的作用.     

miR-204对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨miR-204在人乳腺癌组织及MCF-7细胞中的表达水平及其对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 提取癌症和肿瘤基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库中浸润性乳腺癌的miR-204相关数据进行汇总,转染miR-204过表达病毒,筛选稳定转染细胞株并通过RT-qPCR检测转染率,MTT法检测过表达miR-204后乳腺癌MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 miR-204在浸润性乳腺癌组织中的表达水平较癌旁组织明显下调（P＜0.001）,且与淋巴结转移和远处转移相关（P＜0.05）。过表达miR-204能够抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力（P＜0.05）;miR-204上调后,细胞凋亡率达到（34.7±1.9）%,细胞凋亡能力明显增强（P＜0.001）。结论 miR-204可抑制乳腺癌细胞增殖并介导细胞凋亡。     

慢病毒介导高表达OTUD7B对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为影响

目的 去泛素化酶OTUD7B与肿瘤的发生、发展密切相关.为了明确OTUD7B在乳腺癌中所发挥的作用,实验利用慢病毒构建高表达OTUD7B载体感染MCF-7乳腺癌细胞后对其生物学行为的影响.方法 构建带有绿色荧光蛋白标签的人OTUD7B表达质粒的慢病毒(pEGFP-hOTUD7B)及对照(pEGFP-CI)感染MCF-7乳腺癌细胞;于荧光倒置显微镜下观察病毒转染效果及应用蛋白质印迹法及免疫组化法检测OTUD7B的表达水平;MTS法检测实验组(pEGFP-hOTUD7B)、阴性对照组(pEGFP-CI)和正常对照组对MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响;应用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 感染病毒后于荧光倒置显微镜下观察病毒感染效率,可见病毒感染成功.应用蛋白质印迹法检测病毒感染率并找出最适病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI),当MOI=30时,实验组、阴性对照组和正常对照组灰度值分别为3.81±0.08、2.12±0.078和2.05±0.15,差异有统计学意义,F=402.03,P<0.001.应用免疫组化法可见感染OTUD7B表达水平.MTS法结果显示,实验组、阴性对照组和正常对照组细胞24 h A值分别为0.36±0.08、0.56±0.25和0.69±0.17,F=11.819,P<0.001;48 h A值分别为0.65±0.17、1.45±0.48和1.82±0.63,F=23.752,P<0.001;在72 h A值分别为0.73±0.21、1.58±0.63和1.99±0.27,F=35.563,P<0.001.细胞划痕试验显示,24 h后实验组组迁移率为(7.7±0.91)%,阴性对照组和正常对照组迁移率分别为(13.4±1.52)%和(12.1±1.32)%,F=49.36,P<0.001,48 h后实验组迁移率为(12.4±1.29)%,阴性对照组及正常对照组迁移率分别为(32.9±1.71)%和(31.8±1.59)%,F=504.50,P<0.001.流式细胞仪检测细胞凋亡结果提示,实验组与阴性对照组及正常对照组相比明显使细胞阻滞在G0/G1期,促进其凋亡,FG0/G1期=425.102,FS期=135.063,均P<0.001.结论 成功构建了能够高表达OTUD7B的慢病毒载体,明显抑制了MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移,并促进了其凋亡.     

siRNA沉默DNMT1对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

目的 靶向人DNMT1（DNA methyltransferase 1, DNMT1）构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法 靶向DNMT1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA) 的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-DNMT1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR 法检测DNMT1 mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT 法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR 法分析沉默DNMT1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果 在构建的靶向DNMT1的shRNA重组质粒pGCsi-DNMT1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调DNMT1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-DNMT1对乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-DNMT1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G₁/G₀期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论 重组质粒pGCsi DNMT1能特异有效地抑制MCF-7细胞内DNMT1的表达、 抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制DNMT1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示DNMT1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。     

白藜芦醇抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的机制研究

研究白藜芦醇对MCF-7乳腺癌细胞抑制效应及其作用机制。方法：以人MCF-7乳腺癌细胞株为研究对象,利用MTT方法研究白藜芦醇抑制MCF-7乳腺癌细胞的生物学效应;观察在ERK1/2抑制剂PD98059预处理情况下,白藜芦醇抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖效应的改变;利用免疫印迹方法观察白藜芦醇对MCF-7乳腺癌细胞中ERK1/2与AKT信号分子的蛋白表达。结果：白藜芦醇能够明显降低MCF-7乳腺癌细胞增殖能力,该作用呈一定的浓度依赖性关系。在ERK1/2抑制剂PD98059预处理情况下,白藜芦醇对MCF-7乳腺癌细胞增殖抑制效应能明显抑制,PD98059可明显减轻该效应。同时,白藜芦醇明显增加p-ERK1/2蛋白表达,降低p-AKT表达水平,但对ERK1/2与AKT蛋白表达无改变。结论：白藜芦醇能够有效抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖,该效应与白藜芦醇对ERK1/2及AKT信号途径的调节有关。     

lncRNA RP3-340N1.2 在乳腺癌组织中的表达及其对MCF-7 细胞增殖和迁移的影响

目的:观察长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）RP3-340N1.2 在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌MCF-7 细胞增殖和迁移的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：收集湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心2017 年1 月至2017 年9月13 例行乳腺癌根治术切除的癌组织及相应的癌旁组织标本,采用qRT-PCR检测13 例乳腺癌组织及癌旁组织、乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞中RP3-340N1.2 的表达差异。使用Lipofectamine 3000 转染试剂分别将RP3-340N1.2 质粒（实验组）和阴性对照质粒（对照组）转染至乳腺癌MCF-7 细胞,CCK-8 法和Transwell 迁移实验检测RP3-340N1.2 过表达对MCF-7 细胞增殖、迁移能力的影响。qRT-PCR检测RP3-340N1.2 过表达对miR-134-5p 和OPCML mRNA表达的影响,Western blotting 检测OPCML相关蛋白的表达水平。结果：RP3-340N1.2 在乳腺癌组织中表达明显低于癌旁组织（P<0.01）,其在乳腺癌细胞株中表达水平明显低于正常乳腺上皮细胞（P<0.01）。上调RP3-340N1.2 的表达抑制MCF-7 细胞的增殖和迁移能力（均P<0.05）。过表达RP3-340N1.2 后MCF-7 细胞中miR-134-5p 表达水平明显降低（P<0.01）、OPCML mRNA 和蛋白的表达水平升高（P<0.01）,而周期调控蛋白CDK4、Cyclin D2 的表达水平下调,细胞迁移调控蛋白Vimentin 和N-cadherin 蛋白表达下调（均P<0.01）。结论：RP3-340N1.2 在乳腺癌组织和细胞株中低表达,上调RP3-340N1.2 的表达可引起miR-134-5p 的表达降低、OPCML mRNA表达升高,从而抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。     

甲异靛对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡影响的实验研究

目的:研究甲异靛对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法:采用MTT法检测甲异靛对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制;流式细胞仪测定细胞凋亡率;光学显微镜观察细胞形态的变化;westernblot法测定caspase-3、PARP及bcl-2表达。结果:甲异靛能明显抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖。甲异靛诱导MCF-7细胞凋亡,呈现典型细胞凋亡的形态变化,并呈时间和剂量依赖性,凋亡率最高可达(68.40±4.87)%,在细胞凋亡过程中出现PARP分子断裂和bcl-2下调,未检测到caspase-3。结论:甲异靛能诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡抑制细胞增殖,其发生机制可能与下调bcl-2有关。     

Extracellular matrix,Rac1 signaling,and estrogen-induced proliferation in MCF-7 breast cancer cells

Estrogen receptor positive (ER+), estrogen (E) responsive MCF-7 breast cancer cells cultured on the extracellular matrix (ECM) protein laminin (LM), exhibit significantly reduced E-induced proliferation compared with cells cultured on collagen I (Col I) that is not due to a loss of ER. Based on reported differences in integrin-activated pathways on Col I vs. LM, we investigated the potential role of Rac1/c-jun-N-terminal kinase (JNK) activation and downstream regulation of cyclin D1 by E on Col I vs.LM. E-induced proliferation was increased on LM in MCF-7 cells expressing constitutively active Rac1 (CA Rac1) and decreased in dominant negative Rac1-(DN Rac1) expressing cells on Col I. siRNA knockdown established the specificity and requirement for Rac1 activation for E-induced regulation of cyclin D1. More robust c-Jun activation occurred on Col I than on LM and E-induced proliferation was abolished after treatment with a JNK inhibitor. These results provide evidence that Rac1/JNK/c-Jun activation promotes E-induced proliferation on Col I and reduced Rac1/JNK/c-Jun activation on LM contributes significantly to reduced E-induced proliferation in MCF-7 cells on LM. These results identify a novel role for extracellular matrix (ECM)-integrin regulation of Rac1-JNK pathway in E-regulated proliferation in ER+ breast cancer cells. These findings suggest that tumor stromal environment, i.e., ECM composition, may contribute to loss of E regulation in ER+ breast cancers. Defining molecular markers for early identification of ER+ tumors that are ER+ but antiestrogen resistant would allow the design and use of alternative therapies to inhibit tumor growth and improve survival.     

AQP1通过Wnt通路促进乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移与侵袭

目的:探讨过表达水通道蛋白1（aquaporin 1,AQP1）基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移、侵袭能力的影响,分析其对Wnt通路的调控作用。方法:构建和包装pBabe-puro-AQP1逆转录病毒载体,建立稳定过表达AQP1基因的MCF-7细胞。细胞免疫荧光染色法检测外源性AQP1在MCF-7细胞内的定位,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测AQP1 mRNA及蛋白表达变化;采用CCK-8法检测细胞的增殖活性;流式细胞法检测细胞周期;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞的侵袭能力;基因表达谱芯片、Western blot检测转染后Wnt细胞通路相关基因表达改变。结果:稳定过表达AQP1后MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加,差异有统计学意义（P＜0.001）。基因表达谱芯片结果显示,过表达AQP1后22个差异表达基因富集于Wnt细胞信号通路,mRNAs表达明显增强（P＜0.000 1）,Wnt细胞通路关键基因β-catenin及下游靶基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-Myc蛋白表达也显著增加。结论:AQP1可能通过激活Wnt信号通路促进MCF-7细胞增殖、迁移与侵袭。     

辛伐他汀对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用及机制研究

目的 探讨辛伐他汀（SVA）体外对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用及其可能的机制。 方法 选用人乳腺癌MCF-7细胞进行体外培养,采用四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度SVA（0、3.25、6.25、12.5、25、50和100 μmol／L）处理MCF-7细胞24、48、72 h后的增殖抑制作用,荧光染色法观察SVA（0、2和4 μmol／L）处理MCF-7细胞48 h后的凋亡形态学变化,流式细胞仪测定SVA（0和4 μmol／L）处理MCF-7细胞48 h后的细胞周期变化,免疫印迹法分析SVA（0、2、4和8 μmol／L）处理MCF-7细胞72 h后细胞内Bcl-2和Bax蛋白水平的表达。结果 不同浓度SVA处理不同时间后,MCF-7细胞的增殖明显受到抑制,且增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性;荧光显微镜观察发现SVA能够诱导MCF-7细胞出现核固缩、染色质凝集等凋亡形态学改变。流式细胞仪检测细胞周期显示,SVA阻滞MCF-7细胞于G0／G1期。免疫印迹 结果 显示,SVA处理组的Bcl-2蛋白表达水平低于对照组,Bax蛋白表达水平明显高于对照组,且随SVA浓度的增高,Bcl-2蛋白水平逐渐降低,Bax蛋白水平逐渐升高。结论 SVA对人乳腺癌MCF-7细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度和时间依赖性,其抗肿瘤机制可能与诱导细胞周期阻滞、下调Bcl-2蛋白及上调Bax蛋白表达有关。     

RhG-CSF对乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的影响

目的：探讨人重组粒细胞集落刺激因子（RhG-CSF）对乳腺癌细胞株MCF-7的增殖作用的影响。方法：体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7,将含不同浓度RhG-CSF的培养液与MCF-7细胞共同培养不同时间,采用MTT比色法计算细胞生长增殖率;Anexxin V/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率。实验结果用SPSS.v16.0软件分析。结果：不同浓度RhG-CSF处理细胞后,可以显著促进MCF-7细胞株的增殖（P〈0.01）,且当浓度为10μg/L时增殖作用最强。同时各浓度的RhG-CSF亦可抑制MCF-7细胞凋亡（P〈0.01）。结论：RhG-CSF可以显著促进人乳腺癌细胞株MCF-7增殖。当浓度小于10μg/L时,增殖呈浓度依赖性。大于10μg/L时,增殖能力反而逐渐下降。同时RhG-CSF亦可抑制MCF-7细胞凋亡。     

miRNA-541-5p负调控细胞周期蛋白D1抑制结肠癌细胞增殖和迁移的相关研究

目的:探讨miRNA-541-5p（miR-541-5p）负调控细胞周期蛋白D1（CCND1）对结肠癌细胞增殖和迁移的影响及其相关机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-541-5p在结肠癌细胞株HT29、SW480、SW620、HCT116和正常人肠上皮细胞株HIEC以及2017年4月至...     

LMAN2在HR阳性乳腺癌组织中的表达与患者预后的关系及其对MCF-7细胞增殖和迁移的影响

目的：探究甘露糖结合凝集素2(LMAN2)在激素受体（HR）阳性乳腺癌组织中的表达水平与乳腺癌患者预后的关系及其对MCF-7细胞增殖和迁移的影响。方法：通过TCGA、Bc-GenExMiner、GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库分析LMAN2在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的差异性表达及其与患者预后的关系。采用小RNA干扰技术将si-LMAN2#1、si-LMAN2#2及si-NC转染至MCF-7细胞,将过表达LMAN载体（pc-LMAN）及空载体pcDNA3.1阴性对照（pc-NC）转染至MCF-7细胞,实验分为si-LMAN2#1、si-LMAN2#2、si-NC、pc-LMAN2和pc-NC组。通过qPCR和WB实验检测各组细胞中LMAN2 mRNA和蛋白的表达水平,CCK-8、克隆形成、Transwell迁移、WB等实验检测敲低和过表达LMAN 2对MCF-7细胞增殖、克隆形成、迁移及AKT信号通路相关蛋白表达的影响。结果：LMAN2在乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常乳腺组织（P<0.001）。HR阳性乳腺癌组织中LMAN2表达水平显著高于HR阴性乳...     

Matrix metalloproteinase-9 is required for tubular network formation and migration of resistant breast cancer cells MCF-7 through PKC and ERK1/2 signalling pathways

Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) strongly influences tumor development and metastasis. Using resistant (rMCF-7) and sensitive (sMCF-7) breast cancer lines we investigated the role of MMP-9 in cell migration (CM) and tubular network (TN) formation, two processes implied in tumor growth and metastasis. Our data demonstrate that MMP-9 which is critical for CM is necessary but not sufficient for TN formation and suggest a link between MDR1/P-gp and constitutive MMP-9. Both TN formation and CM are dependent on PKC and ERK1/2 pathways.