颅神经嵴干细胞的体外培养及其多向分化潜能研究

目的　分离培养颅神经嵴干细胞,探讨其体外生物学特征,为进一步研究其牙、颌向分化提供细胞来源。方法　取小鼠胚胎颅段神经管,组织块法无血清条件培养获颅神经嵴干细胞,形态学、BurdU掺入及免疫细胞化学法鉴定其生物学性状。结果　原代培养的颅神经嵴干细胞为梭形成纤维样细胞,表现为克隆样生长、自我更新能力和多向分化能力等干细胞性状,且特异性标记物HNK-1呈阳性表达。结论　本研究成功地获取保持有多潜能干细胞性状的颅神经嵴细胞,为深入研究其牙、颌向分化奠定基础。     

毛囊bulge干细胞培养方法的比较研究

目的通过对限定性角质形成细胞无血清培养基（DK-SFM）和3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的比较,寻求既能方便获得大量毛囊bulge干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。方法采用DK-SFM和3T3滋养层分别培 养毛囊bulge干细胞,通过倒置显微镜观察毛囊bulge干细胞的形态,免疫荧光染色检测毛囊bulge干细胞的特异性标 记细胞角蛋白19（CK19）和分化相关抗体群34（CD34）的表达鉴定毛囊bulge干细胞。通过比较2种方法培养的毛囊bulge干细胞的克隆形成率和CD34阳性率的差异,分别比较毛囊bulge干细胞的增殖能力和干细胞的数量,综合评估 2种培养方法的优劣。结果倒置显微镜观察2种培养方法所得毛囊bulge干细胞均为铺路石状。免疫荧光染色检测 2种培养方法培养的毛囊bulge干细胞CK19和CD34均呈阳性。DK-SFM和3T3滋养层培养的毛囊bulge干细胞克隆形成 率分别为69.4%和62.2%。流式细胞仪检测DK-SFM培养的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为72.3%;3T3滋养层培养 的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为34.7％。结论DK-SFM和3T3滋养层培养作为毛囊bulge干细胞的2种培养方法, 均可以获得未分化的毛囊bulge干细胞。用3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的方法比较复杂,且所获的细胞混杂有 3T3细胞,但用此种方法可获得大量的毛囊bulge干细胞。用DK-SFM培养毛囊bulge干细胞方法简单,但细胞不易贴 壁,且数量较少,但能有效分离出较纯的毛囊bulge干细胞,保持较好的细胞活性。     

小鼠颅神经嵴细胞的培养和特征

目的：在体外原代培养Balb/c小鼠胚胎的颅神经嵴细胞。为颅面部各种组织细胞的发育研究提供细胞来源。方法：采用胰酶消化法分离小鼠胚胎第8.5天的颅神经管，从小鼠颅神经管中游离出来的细胞即为颅神经嵴细胞，用免疫组织化学方法鉴定细胞的来源，并测定细胞的生长曲线。结果：成功地培养出小鼠的颅神经嵴细胞，其形态类似成纤维样细胞，免疫组化检测结果表明，神经特异性烯醇化酶（NSE）抗体染色结果阳性。细胞的群体倍增时间为43.65h。结论：原代培养的小鼠颅神经嵴细胞生长稳定，来源明确，是颅面部各种细胞的发育和分化研究中一种有用的工具。     

诱导颅神经嵴细胞向第一鳃弓外胚间充质细胞分化的实验研究

目的 研究体外成纤维细胞生长因子8(FGF-8)对颅神经嵴细胞向第一鳃弓表型分化的影响，并确立其时相效应，为进一步探讨颅神经嵴细胞的牙颌向分化诱导提供实验依据。方法 组织块法无血清条件培养颅神经嵴细胞，通过同源盒基因Hoxa2原位杂交及波形蛋白免疫细胞化学染色，观察不同剂量FGF-8对颅神经嵴细胞迁出前、后及其向第一鳃弓外胚间充质细胞表型分化的影响。结果 迁出前颅神经嵴细胞在100μg／LFGF-8作用下，呈现Hoxa2阴性表达、波形蛋白阳性表达，迁出后颅神经嵴细胞诱导组及对照组Hoxa2、波形蛋白表达均为阳性。结论 FGF-8可诱导颅神经嵴细胞向第一鳃弓外胚间充质细胞表型分化，具有早期诱导时相性特征。     

牙本质非胶原蛋白诱导颅神经嵴干细胞向成牙本质细胞表型分化

目的探讨颅神经嵴干细胞(CNCSC)用于牙再生研究的可行性,观察牙本质基质非胶原蛋白(DMNCP)对CNCSC的成牙本质样细胞表型分化的影响。方法小鼠神经管组织块无血清条件培养法获取颅神经嵴干细胞,以DMNCP体外诱导CNCSC的分化,形态学、免疫细胞化学、茜素红特染等方法,分别从Ⅰ型胶原表达、牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙结节形成情况,鉴定CNCSC的成牙本质样细胞表型。结果诱导后的CNCSC呈现I型胶原、DSPP阳性表达,ALP活性增高,钙结节形成,具有成牙本质细胞表型特征。结论DMNCP具有诱导CNCSC向成牙本质细胞表型分化的作用,利用CNCSC开展牙再生研究是可行的。     

人类牙乳头细胞的体外培养及细胞生物学性状研究

目的　体外分离培养人类牙乳头细胞,并对传代细胞的生物学特性进行研究。方法　选择3~4月胎龄 的自然流产人胚胎,分离牙乳头,组织块法培养人类牙乳头细胞并鉴定。观察细胞的生长特性,经Ⅰ型胶原、纤维 粘连蛋白和层粘连蛋白免疫细胞化学染色及细胞矿化诱导后的钙盐染色对细胞的生物学性状进行研究。结果　 分离培养的人类牙乳头细胞在体外生长良好,细胞及分泌基质中的Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白表达阳 性。将培养细胞行矿化诱导后,细胞可形成钙化基质。结论　通过机械分离及贴壁法可获得人类牙乳头细胞,其 传代细胞在基质形成和矿化能力方面与体内人牙乳头细胞有相似性,有潜力作为牙组织工程的种子细胞。     

p75神经营养受体阳性外胚间充质干细胞的体外获取与生物学特性研究

目的 研究鼠胚胎颌面组织中外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSC)的生物学特性,探讨p75+EMSC的体外分化及影响因素,为揭示牙齿发生、发育机制提供实验依据.方法 通过提取12.5 d SD鼠胚胎颌面组织,用免疫荧光染色方法显示EMSC的迁移位置;用p75神经营养因子受体标记EMSC,通过流式细胞技术分选出p75+EMSC,并检测细胞周期和干细胞相关细胞表面抗原.结果 免疫荧光染色结果说明颅神经嵴源性干细胞在鼠胚胎12.5 d迁移到颌突中.p75+EMSC的阳性分选率为6.1％,细胞呈均匀成纤维细胞形态,生长曲线呈“S”型,在传代过程中S期的比例稳定.细胞特异性标志物CD29、CD146、Stro-1标记p75+EMSC,其在p75+EMSC中的表达均较高(＞90％).结论 SD鼠受孕12.5 d时,胚胎的牙齿启动尚未发生;分选后的p75+EMSC在传代过程中具有稳定的增殖能力和干细胞特征,尚未开始分化.     

牛牙骨质来源细胞的分离、培养和鉴定

目的 探索体外分离培养牙骨质来源细胞（cementum-derived cells,CDC)的方法，并研究其生物学特性。方法 用组织法联合酶消化法，分离培养新生牛牙根表面的细胞；免疫细胞化学方法检测CDC中与骨相关的标志物如骨钙素、碱性磷酸酶和特异性牙骨质附着蛋白的表达；改良钙钴法检测碱性磷酸酶的活性。结果 培养增殖的细胞具有成牙骨质细胞的形态特征，经5次传代后细胞形态无明显改变；该细胞骨钙素、碱性磷酸酶免疫细胞化学染色均为阳性，并有碱性磷酸酶活性表达；牙骨质附着蛋白呈阳性着色。结论 初步确定本实验首次成功分离培养了牛牙骨质来源的、具成牙骨质细胞特性的成牙骨质细胞。为进一步研究成牙骨质细胞的生物学特性及牙骨质生成和修复提供了条件。     

p75神经营养蛋白受体阳性舌鳞状细胞癌细胞的生物学特性研究

目的 对流式细胞仪分选获得的p75神经营养蛋白受体（p75NTR）阳性舌鳞状细胞癌细胞进行生物学特性研究。方法 通过流式细胞术检测舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113和Cal-27中p75NTR阳性细胞的表达。对流式细胞仪分选获取的 p75NTR阳性细胞进行单克隆培养、四甲基偶氮唑盐比色法及划痕实验检测,以未分选细胞为对照,分析 p75NTR阳性细胞的生物学特性。结果 舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113、Cal-27中,p75NTR阳性细胞的比例分别为3.1％和1.9％。与未分选的细胞相比,p75NTR阳性细胞的单克隆形成能力更高（ Tca-8113细胞, P=0.024;Cal-27细胞,P=0.009）;单克隆 p75NTR阳性细胞再培养 2周后, p75NTR阳性细胞率分别降为14.5%（Tca-8113）和5.8%（Cal-27）;p75NTR阳性细胞体外增殖能力显著增强,且具有明显的侵袭迁移能力。结论 p75NTR阳性舌鳞状细胞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。     

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

血清对神经嵴细胞向神经胶质细胞分化诱导的体外研究

目的：探讨神经嵴细胞在含血清培养基中向神经细胞的自发分化过程，方法：取妊娠第8．5天的BALB／c胎鼠的神经嵴细胞，分别在无血清和含血清培养基中培养，免疫组化和透射电镜鉴定和观察神经嵴细胞的分化情况.结果：在无血清的培养基中，NSE染色结果阳性，透射电镜下未见神经内分泌颗粒，神经嵴细胞保持其原有的特性，在有血清的培养基中，神经嵴细胞自发分化，胶质纤维酸性蛋白（GFAP），神经特性烯醇化酶（NSE）和S－100染色阳性，透射电镜下可见大量的神经内分泌颗粒。结论：血清可使神经嵴细胞自发的向神经胶质细胞分化。     

Human dental follicle cells express embryonic,mesenchymal and neural stem cells markers

ObjectiveThis study was conducted to identify and characterize dental follicle stem cells (DFSCs) by analyzing expression of embryonic, mesenchymal and neural stem cells surface markers. Design Dental follicle cells (DFCs) were evaluated by immunocytochemistry using embryonic stem cells markers (OCT4 and SOX2), mesenchmal stem cells (MSCs) markers (Notch1, active Notch1, STRO, CD44, HLA-ABC, CD90), neural stem cells markers (Nestin and β-III-tubulin), neural crest stem cells (NCSCs) markers (p75 and HNK1) and a glial cells marker (GFAP). RT-PCR was performed to identify the expression of OCT4 and NANOG in DFCs and dental follicle tissue.ResultsImmunocytochemistry and RT-PCR analysis revealed that a significant proportion of the DFCs evaluated expressed human embryonic stem cells marker OCT4 (75%) whereas NANOG was weakly expressed. A considerable amount of MSCs (90%) expressed Notch1, STRO, CD44 and HLA-ABC. However, they were weakly positive for CD90. Moreover, it was possible to demonstrate that dental follicle contains a significant proportion of neural stem/progenitors cells, expressing β-III-tubulin (90%) and nestin (70%). Interestingly, immunocytochemistry showed DFCs positive for p75 (50%), HNK1 (<10%) and a small proportion (<20%) of GFAP-positive cells. This is the first study reporting the presence of NCSCs and glial-like cells in the dental follicle.ConclusionsThe results of the present study suggest the occurrence of heterogeneous populations of stem cells, particularly neural stem/progenitor cells, in the dental follicle, Therefore, the human dental follicle might be a promising source of adult stem cells for regenerative purposes.     

哺乳动物外胚间充质细胞的表型和形态学研究

目的：探讨胚胎中外胚间充质细胞表型和形态鉴定。方法：取E12 SD大鼠胚胎颌突组织进行免疫组化鉴定和电镜观察。结果：免疫组化抗LNGFR、NF、NSE、S100、Vimentin呈阳性着色，抗GFAP呈阴性着色；细胞主要为间充质样细胞，形状不规则，呈多突起的星形或梭形，突起不规则；核、浆比例大；核仁明显，大、靠边；常染色质多，异染色质少；含有大量的线粒体及少量粗面内质网及核糖体。电镜结果显示细胞代谢旺盛，增殖活性高，处于未分化状态。结论：外胚间充质中存在表达神经嵴前体细胞标志LNGFR的细胞，而且这些细胞在形态上也明显处于未分化状态，说明在迁移后的神经嵴细胞中仍然含有未分化的多能前体细胞。     

体外分离培养大鼠毛囊真皮鞘细胞

目的 :扩增培养纯化的大鼠毛囊真皮鞘细胞。方法 :以新生SD大鼠毛囊为原材料 ,机械法分离真皮鞘 ,胶原酶消化 ,获取毛囊真皮鞘细胞 ,体外培养 ,并免疫组化方法鉴定细胞。结果 :通过消化法成功培养了大鼠毛囊真皮鞘细胞 ,并扩增至第六代。结论 :本方法可以快速高效的获得大量真皮鞘细胞。     

小鼠牙囊细胞的体外培养及表型特征

目的　建立小鼠牙囊细胞(DFC)的体外分离培养方法,研究牙囊细胞的表型特征。方法　用1%的胰蛋白酶消化分离9 d龄Balb/c小鼠的下颌第一磨牙牙胚的牙囊组织进行体外培养,倒置显微镜下观察细胞的形态,扫描电镜观察细胞的表面形貌,SP免疫组化法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)的表达。结果　分离培养的细胞有3种类型:立方形或多角形;长梭形;非常细长的细胞形状。扫描电镜下细胞具有多形性,有大量的线状胞浆突和微绒毛;根据细胞表面有无纤维细丝覆盖,可将细胞分为有纤维细丝、无纤维细丝两个亚群。免疫组化染色显示部分牙囊细胞的ALP、BSP、OPN的表达阳性。结论　牙囊细胞具有多种细胞的表型特征, 有分化为成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的潜能。     

鸟苷酸交换因子Trio通过调控神经嵴细胞迁徙影响颅颌面发育

目的:研究鸟苷酸交换因子Trio在胚胎发育过程中对神经嵴细胞的影响.方法:将trio反义寡核苷酸通过显微注射入斑马鱼胚胎内,抑制其trio功能;在斑马鱼胚胎发育96 h时使用体式显微镜观察神经嵴细胞衍生物下颌骨的发育情况,120 h时通过阿尔辛蓝染色观察颅颌面部软骨的发育状况.利用转基因斑马鱼(sox10:EGFP)特...