慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。     

慢病毒介导的RNA干扰对小鼠胰腺星状细胞中半乳糖凝集素-1基因沉默效应的研究

目的:评价慢病毒介导的RNA干扰技术对小鼠胰腺星状细胞(mPSC)中半乳糖凝集素-1(galectin-1)基因的沉默效应,并观察其对mPSC增殖的影响。方法:设计并合成3条galectin-1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒PLKO.1-PURO载体中。从慢病毒包装转染的293T细胞,获得病毒上清感染的mPSC;采用嘌呤霉素(2μg/μL)筛选出慢病毒感染成功的mPSC。实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测mPSC中galectin-1 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测mPSC的增值能力。结果:PCR扩增和测序表明成功构建galectin-1慢病毒干扰载体,可以有效沉默mPSC中galectin-1基因的表达。构建的RNAi慢病毒载体感染mPSC后galectin-1 mRNA表达量同对照组比较,分别为(19.4±4.8)%、(6.2±4.3)%、(27.6±5.7)%,galectin-1蛋白表达量同对照组比较分别为(25.9±3.6)%、(10.8±4.1)%、(30.2±3.2)%。稳定的galectin-1沉默mPSC在第4天细胞增殖能力下降(22.9±2.7)%(P     

人色素上皮衍生因子慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人色素上皮衍生因子(human pigment epithelium-derived factor,hPEDF)慢病毒载体,包装过表达PEDF的慢病毒,构建过表达PEDF的人角质形成细胞(human keratinocyte, Ha Ca T)的细胞株。方法将PEDF基因插入慢病毒载体p LVX-IRES-puro,构建p LVX-IRES-puro-PEDF慢病毒重组质粒并转染293T细胞,包装获得病毒上清,进行病毒扩增,收集病毒上清液,测定扩增后的病毒滴度。扩增后的病毒上清液以最佳感染复数感染体外培养的Ha Ca T细胞作为Ha Ca T-PEDF组(实验组),同时以含有空载体的慢病毒感染Ha Ca T细胞株作为Ha Ca T细胞组(对照组),扩增72 h后收集两组细胞及条件培养基,通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blot, WB)技术检测各组细胞PEDF基因m RNA以及蛋白的表达情况,通过酶联免疫吸附试验检测两组细胞PEDF蛋白分泌情况。结果经限制性内切酶酶切鉴定、Sanger测序证实,成功构建了携带PEDF基因的重组慢病毒表达载体,且包装的慢病毒滴度可达1×107pfu/ml。RT-PCR和WB检测结果显示,实验组细胞中PEDF的m RNA和蛋白均显著高于对照组(P0.05),并能分泌至细胞外。结论成功构建了表达PEDF基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功感染Ha Ca T细胞,并高表达PEDF蛋白。     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

针对人STAT1基因的RNA干扰有效靶点的设计与筛选

目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点。方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-timePCR检测干扰效果。结果:测序证实3个STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48h后,STAT1基因在mRNA水平表达均受到抑制,其中MHCC9-L-stat1-shRNA-1序列效果最佳,对STAT1基因表达的干扰效率可达81.4%。结论:成功构建并筛选了人STAT1基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究STAT1基因与抗肿瘤药物药效关系奠定基础。     

靶向人VEGF165的SiRNA慢病毒的构建和鉴定

目的：构建靶向VEGF基因的SiRNA慢病毒载体,并包装病毒。方法：针对已经筛选确定的SiRNA有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,经双酶切后与PGC SIL-GFP慢病毒载体连接,构建慢病毒载体PGCSIL-SiVEGF,以293T细胞包装得到干扰病毒LV-SiVEGF,根据细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过定量RT-PCR检测VEGF的mRNA表达。结果：测序结果表明,靶向人VEGF的SiRNA慢病毒载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为2×109 ifu/μl;感染HUVEC细胞后,实验组和对照组相比VEGF mRNA表达水平显著降低。结论：成功构建人VEGF SiRNA慢病毒LV-SiVEGF。     

人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定

目的探索以小干扰RNA（si RNA）慢病毒干扰载体组建的慢病毒对人Hep G2细胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效应。方法构建4种针对Id1基因不同干扰靶点的Id1-siRNA慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFPId1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）,将其转染至293T细胞,以筛选出针对Id1基因的最有效的RNA干扰（RNAi）靶序列。再以沉默效果最优的干扰载体进一步构建慢病毒（Id1-RNAi-LV）,感染人HepG2细胞后,采用实时定量PCR法和Western blot法分别检测其Id1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果与pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组及p CGSIL-GFP-Id1-3组比较,pCGSIL-GFP-Id1-4组的Id1蛋白表达水平最低（P〈0.05）,沉默效果最优。以pCGSIL-GFP-Id1-4干扰载体组建慢病毒后,测得慢病毒的病毒滴度为2.0×10^9 TU/mL。与空白对照组和阴性对照组比较,以组建的慢病毒感染人HepG2细胞后,人HepG2细胞中Id1m RNA及其蛋白的表达水平均降低（P〈0.05）。结论本实验构建的特异性慢病毒可稳定地介导Id1基因的沉默。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达的研究

[目的]构建携带绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体系统,通过感染大鼠软骨细胞,观察其感染能力及GFP的表达情况.[方法]以载体质粒pLentiLox 3.7、包装质粒pRSV-REV、pMDL g/p RRE及包膜质粒VSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.分离、培养大鼠关节软骨细胞,将制备好的慢病毒颗粒感染软骨细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况.[结果]重组慢病毒载体系统转染293T细胞96 h后可观测到较强的绿色荧光蛋白的表达,收集上清测得病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,并且在80%大鼠软骨细胞中观察到GFP的表达.[结论]成功构建了携带GFP的重组慢病毒载体系统,对大鼠关节软骨细胞转染效果良好,为将来结合RNA干扰技术对软骨细胞进行基因改造提供了基础.     

人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定

【摘要】〓目的〓构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础。方法〓利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度。将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达。结果〓重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强。结论〓通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体。     

人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

VEGF165慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建VEGF165慢病毒包装质粒,通过慢病毒介导VEGF165感染入骨髓间充质干细胞(hBMSCs)并验证其表达情况,为高表达VEGF的HBMSCs应用于血管再生和治疗临床创面愈合提供研究基础. 方法 2012年3月至2013年3月,采用聚合酶链式反应(PCR)从提取的人体组织总RNA逆转录扩增VEGF165,经双酶切后与pLVX-IRES-ZsGreen1真核载体连接,在脂质体介导下将重组质粒转染293T细胞,包装产生的病毒液感染HBMSCs,荧光显微镜下观察VEGF165荧光融合蛋白表达,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测VEGF165 mRNA的表达.对结果用SPSS13.0统计软件进行分析,P＜0.05为差异有统计学意义. 结果 双酶切产物于576 bp处出现特异性条带,测序结果与预期符合,表明所构建重组质粒pLVX-IRES-ZsGreen1+VEGF165结构正确.构建质粒转染293T细胞并产生高滴度含目的基因VEGF165的慢病毒,感染hBMSCs后,细胞在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,qRT-PCR结果显示慢病毒感染组VEGF165 mRNA表达水平为32.27±1.05,显著高于对照组(P＜0.05). 结论 成功构建VEGF165慢病毒包装质粒,并感染hBMSC,为其基因治疗应用于临床提供了依据.     

微小RNA-29b-1*和微小RNA-29c对膀胱癌T24细胞增殖的影响

目的 观察微小RNA(miR)-29b-1*和miR-29c对膀胱癌T24细胞的活性和增殖的影响.方法 构建携带目标miRNAs干扰基因的慢病毒(pGCsil-H1-CMV-GFP)载体、阳性克隆的聚合酶链反应(PCR)鉴定.用293T细胞包装慢病毒形成慢病毒重组体,并用孔稀释法测定滴度.T24细胞中转染慢病毒重组体及转染效率测定.用噻唑蓝(MTT)比色法对4组处于对数生长期的实验组[空细胞对照组、转染阴性对照慢病毒细胞组、转染miR-29b-1*基因RNA干扰(RNAi)慢病毒细胞组、转染miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组]进行连续5d的细胞增殖分析.结果 实时定量PCR(Real-time PCR)验证结果显示:T24细胞中miR-29b-1 *和miR-29c表达水平比较于空细胞组分别为3.47和4.40;MTT比色法显示,转染阴性对照慢病毒细胞组与空细胞对照组细胞比较,增殖受到轻度抑制;而转染miR-29b-1*、miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组与染阴性对照慢病毒细胞组和空细胞对照组细胞比较,增殖均受到明显抑制,前者抑制效果更明显.结论 细胞增殖MTT法分析显示通过RNAi降低miR-29b-1*、miR-29c的表达均能引起T24细胞的增殖抑制.     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

慢病毒介导的大鼠白细胞介素-1Ⅰ型受体基因RNA干扰对体外软骨细胞的作用

目的 构建大鼠白细胞介素-1 (IL-1)Ⅰ型受体基因RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并观察其对体外大鼠软骨细胞的作用.方法 筛选确定IL-1 Ⅰ型受体(IL-IR Ⅰ)基因的RNAi有效靶序列,使用293T细胞包装产生慢病毒.收集293T细胞上清液并浓缩,得到滴度为1×107TU/ml的病毒.使用携带有效干扰片段的慢病毒分别以转染倍数(MOI)值20和50感染体外培养的软骨细胞,Westem blot法测定软骨细胞中IL-1R Ⅰ以及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达.结果 适合感染软骨细胞的MOI为50,感染率＞70％.经过RNAi后,体外培养的软骨细胞IL-1R I以及MMP-1蛋白表达显著降低.结论 慢病毒介导的大鼠IL-IR Ⅰ基因干扰能够显著降低体外培养的软骨细胞中IL-IR Ⅰ的表达,并进一步降低下游蛋白MMP-1的表达.     

慢病毒介导的miPSC-EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立

目的建立稳定过表达Yes相关蛋白(YAP)的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞(miP SC-EC)系,为miP SC-EC过表达YAP基因的体内外实验研究奠定基础。方法将模板质粒(p CMV-Flag-YAP2-5SA)改建成慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro);将慢病毒表达质粒与包装质粒组成共包装系统转染293FT细胞;包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,测定滴度。诱导miP SC分化为EC,观察其形态特征,并行组织化学鉴定。包装好的慢病毒感染miP SC-EC,嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系miP SC-EC/YAP,并用RT-PCR及Western blot方法验证。结果慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro)构建成功,并成功包装YAP基因过表达慢病毒,滴度达到1.2×109 TU/ml。miP SC诱导分化所得细胞符合EC形态特征,几乎都表达EC标志CD31。转染YAP的miP SC-EC中YAP m RNA表达水平较未转染细胞明显升高,YAP蛋白高表达(未转染细胞中YAP蛋白几乎不表达)。结论成功构建YAP基因慢病毒过表达载体,诱导miP SC分化为EC,成功建立YAP基因稳定感染细胞系miP SC-EC/YAP。     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

慢病毒介导兔脑红蛋白基因感染骨髓间充质干细胞的实验研究

[目的]构建携带兔脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)基因的重组慢病毒,感染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs),建立稳定表达兔Ngb的BMSCs/Ngb细胞。[方法]构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293 T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(multiplicities of infection,MOI),实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况。[结果]构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293 T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白。[结论]成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因稳定感染至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表...     

慢病毒载体介导RNAi靶向抑制胰腺癌细胞survivin表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的探讨运用慢病毒载体介导的RNA干扰技术对survivin的抑制效率及对胰腺癌细胞SW1990凋亡的影响。方法应用pGCSIL-neo质粒构建3对针对survivin的慢病毒ShRNA载体,转染包装细胞293T,收集病毒上清转染胰腺癌细胞系SW1990,实时荧光定量PCR和western-blot免疫印迹检测癌细胞内survivin的表达;测定caspase3/7活性和DAPI染色检测细胞凋亡。结果成功构建3个survivin-ShRNA慢病毒载体,LV-shRNA-survivin-1对survivn的mRNA和蛋白表达抑制效率分别为73.50%和87.64%;与对照组相比,其caspase3/7活性升高14.5倍,细胞凋亡明显增加(11.95%)。结论慢病毒载体介导的Suvivin-ShRNA靶向转染可有效抑制survivin表达,并显著增加胰腺癌细胞的凋亡。