1株保存的马雅罗病毒基因组序列测定及分析

目的对保存的WJBC株马雅罗病毒(MAYV)基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株的关系及追溯其可能来源。方法将MAYV基因组编码区分10段进行RT-PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM-T easy载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。下载MAYV核苷酸序列,利用MEGA5.0软件构建系统进化发生树。结果与结论 WJBC株MAYV基因组核苷酸(nt)共11 429 nt,编码3679个氨基酸,其中5’端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1,nsP2,nsP3,nsP4;3’端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有26 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5’端和3’端分别有76、290 nt的非编码区。进化树结果显示,WJBC株马雅罗病毒与TRVL4675株MAYV亲缘性最高。     

我国登革1型病毒广州株基因组全序列测定与分析

目的：对引起1980年广州登革热流行的登革1型病毒（GZ／80）株的基因组全序列进行测定,为进一步了解病毒基因组结构与功能的关系。从分子 水平探讨登革病毒的传播和流行规律及致病机制提供依据。方法：用广登革热流行期间从患者血清中分离的GZ／80株病毒感染乳腺,聚鼠脑制备病毒RNA。对基因组编码区分段进行RT－CR扩增,非编码区采用RACE法进行cDNA扩增。然后将特异产物纯化后与pGEM-Teasy载体连接,分别进行克隆测序。结果：GZ／80株基因组全长10735ng,5′和3′非编码区长度分别为94nt和465nt基因组单一的读码框架长度为10176ng,编码3392个氨基酸,与登革1型病毒16007株、WestPac74株、新加坡S275／90株和FGA／89株核苷酸序列的同源性分别为94％,93％,95％和91％;推测的氨基酸序列的同源性分别为98．0％,97．9％和97．1％。结论：GZ／80株基因组大小及结构与已知的登革1型病毒其他地区分离株一致。系统发生树分析显示,GZ／80株属于第Ⅱ基因型,与台湾87株、88株和泰国80株为同一基因型。提示广州登革热流行的病原可能来自我国。     

基孔肯雅病毒WJ0601株基因组全序列测定及分析

目的对保存的基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列进行测定,并阐明该病毒与已报道毒株序列的关系。方法对基孔肯雅病毒基因组编码区分14段进行RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。结果与结论基孔肯雅病毒WJ0601株基因组核苷酸共11826nt,编码3722个氨基酸,其中5′端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4;3′端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有68nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5′端和3′端分别有76nt、526nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与S27-African株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.8%,同属于（ESCA）基因型。     

登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性最高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.     

我国三株登革2型病毒基因组全序列的测定及系统发生树分析

目的：测定我国３株登革２型病毒（ｄｅｎｇｕｅ２ｖｉｒｕｓ,ＤＥＮ２）流行株的全序列并确定其基因型。方法：运用ＲＴ－ＰＣＲ和５′,３′ＲＡＣＥ法测定我国３株登革 全序列,采用邻结法绘制系统发生树。：ＤＥＮ２－０４、４３、４４株的核苷酸及氨基酸差异分布于整个序列之中,ＤＥＮ２－０４与ＤＥＮ２－４３、４４共有２１个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化。ＤＥＮ２－０４株与ＪＡＭ株、越南分离株和泰国分离株同为     

1株辛德毕斯病毒基因组编码区序列测定及分析

目的:对保存的一株辛德毕斯病毒基因组编码区序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的差异.方法:对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,采用DNA Star软件将分段测序结果拼接得到全长编码区序列.结果与结论:此株辛德毕斯病毒基因组编码区全长11 322 nt,编码3 774个氨基酸,其中非结构基因长7 539 nt,编码4种非结构蛋白NSp1,NSp2,NSp3,NSp4;结构基因全长3 735 nt,编码5种结构蛋白E1,E2,E3,6K和C蛋白.非结构基因和结构基因之间有48 nt的不翻译连接区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与HRsp株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.7%,氨基酸序列同源性为99.6%.此株病毒与HRsp株病毒亲缘性最高,同属于南非-欧洲组.     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列测定及分析

目的：对保存的西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列进行测定，了解其与已报道毒株的序列差异及系统进化关系。方法：对Chin-01株病毒基因组编码区分区段进行RT-PCR扩增，分别将扩增产物直接进行测序，采用DNAstar软件将测序片段拼接获得全长编码区序列。结果与结论：Chin-01株基因组编码区全长10302nt，为单一读码框架，编码3434个氨基酸。其中结构蛋白基因为2373nt，依次编码4种结构蛋白(C，PrM，M和E)；非结构蛋白基因全长7926nt，依次编码7种非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。序列同源性分析表明，Chin-01株与埃及Eg101株高度同源，两者氨基酸序列仅有0．3％的差异。该株西尼罗病毒基因组编码区序列已输入GenBank数据库。     

西部马脑炎病毒基因组序列的RT-PCR检测

目的 :建立敏感、特异的西部马脑炎 (westernequineencephalitis,WEE)病毒RT_PCR检测方法。方法 :首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA ,然后以此cDNA为模板 ,进行PCR扩增。并对PCR扩增过程中的模板量、循环数、Mg2 浓度、退火温度和延伸时间等条件进行优化 ,以提高检测的特异性和敏感性。结果 :采用经优化的条件进行PCR扩增获得了约 35 0bp的单一DNA片段 ,其大小与预期的相一致 ,且可自 0 .1TCID50 的病毒液中检测出WEE病毒基因组序列。结论 :所建立的RT_PCR方法可自病毒感染的小鼠脑组织和传代细胞中检测WEE病毒的基因组RNA。     

SEN病毒中国分离株基因克隆及序列分析

目的：测定SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，并对其进行初步分析。方法：根据国外已发表的SEN病毒基因序列设计特异性引物，应用套式PCR方法从一份非甲-非戊型(non-A-E)肝炎患者血清中，分段扩增了包括SENV-D型所有编码区(ORFs)长3175bp的DNA片段，将其克隆到T载体后测序。结果：测序结果经BLAST软件分析，与国外发表的3株D型SEN病毒SENV-D(AX025730)，SENV-D(AB059352)，TTV(AB028668)的核苷酸序列同源性分别为90％，88％和91％；与2株D型SEN病毒SENV-D(AX0Z5730)，TTV(AB028668)0RF1所编码蛋白的氨基酸同源性分别为93％和92％。ORF1蛋白中含有Rep蛋白(在病毒复制中起作用的一种蛋白)的两个保守基序，此外还有一个保守的ATP／GTP结合基序(P-loop)以及若干个高度保守的蛋白激酶磷酸化位点。结论：测定得到了SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，有助于其检测方法及致病性的研究，并为研究SEN病毒的进化地位提供方便。     

1999年新分离的登革病毒福建株基因组非编码区的结构特征

目的：测定和分析我国登革2型病毒福建株（FJ－11）基因组非编码区（NCR）序列,为探讨其结构特征与功能的关系提供依据。方法：从登革2型病毒感染C6／36细胞中提总RNA,采用RACE法扩增病毒基因组5′和3′端片段,分别将其克隆至pGEM-T载体,挑取阳性克隆进行序列测定,利用RNAdraw软件对非编码区二级结构进行预测。结果与结论：我国登革2型病毒FJ－11株基因组5′和3′非编码区长度分别为96nt和454nt,具有黄病毒共有保守序列和二有结构。与登革2型病毒美洲基因型比较显示,5′NCR第69位核苷酸的改变对其二级结构有影响,3′NCR端约70nt能形成相同的保守结构,而前380nt呈现多处核苷酸的差异而导致峡谷者预测的二级结构差异较大,它们可能对病毒基因组RNA的复制起重要作用。     

中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定

首次报道了中国人庚型肝炎病毒基因ｃＤＮＡ的克隆及序列测定。中国庚型肝炎病毒基因全长为９１２８个核苷酸，编码一个长度为２８７０个氨基酸残基的多聚前体蛋白。     

3种重要脑炎病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

目的:建立针对西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelitis virus,VEEV)和亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的多重RT-PCR检测方法.方法:分别针对WNV的NS1基因、VEE的NSP2基因和HeV的G基因设计3对引物,建立了同时检测WNV,VEEV和HeV的多重RT-PCR方法.以不同滴度的病毒评估该检测方法的敏感性,同时以中国地区流行的与脑炎相关的黄病毒属和甲病毒属成员为模板验证该检测方法的特异性.结果与结论:所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增WNV,VEEV和HeV的454 bp,541 bp和723 bp基因片段,敏感度分别达到10 PFU/ml,100 PFU/ml和100 fg/ml;而对中国流行的与脑炎相关黄病毒和甲病毒如日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的扩增均为阴性.结果表明所建立的多重RT-PCR敏感性和特异性良好,可用于3种脑炎病毒的快速鉴定和甄别.     

鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株91001的全基因组序列,并通过比较基因组学研究,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定91001菌株的全基因组序列,利用比较基因组方法对91001与另外2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 91001菌株的基因组包括1条染色体和4个质粒(pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为9609bp,与参考菌株基本一致;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒,长度为70159bp,编码情况与参考菌株基本相同,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异;pMT1质粒长度为106642bp,保留了较多的原始质粒片段,毒力相关基因与参考菌株没有差异;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒,在国内外研究中未曾报道,这一质粒长度为21742bp,具有独立复制能力,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。91001菌株的染色体长度为4595065bp,有4037个编码序列(CDS),其中141个是假基因;染色体中存在着非常丰富的插入序列,由于存在IS序列介导的基因组重排,91001菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析,初步确定了91001菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉伯糖分解代谢阴性以及蜜二糖分解阳性的遗传基础。结论 根据质粒结构、染色体基因组重排、硝酸盐还原阴性的机制以及假基因的分布等信息,推测以91001菌株为代表的田鼠型菌株是原始鼠疫耶尔森菌进化过程中的另一个分支,与现有菌株存在着比较明显的差异;而91001菌株独特的致病性可能与基因组中的假基因或大片段缺失有关。     

感染乳鼠组织中克里米亚-刚果出血热病毒的RT-PCR检测与形态学鉴定

目的：检测并鉴定感染组织中的克里米亚-刚果出血热病毒。方法：分别经皮下与腹腔两种途径感染乳小鼠；应用RT-PCR技术对病毒核酸进行检测；利用透射电镜超薄切片技术对病毒进行形态学鉴定。结果：RT-PCR可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏以及脑组织内检测到病毒核酸，透射电镜下可在肝细胞胞浆内观察到形态典型的病毒粒子。结论：应用RT-PCR技术可以对感染组织中的克里米亚-刚果出血热病毒进行检测，利用透射电镜可以对病毒的形态进行观察与鉴定。