人TAK1基因启动子活性的研究

目的鉴定人TAK1启动子片段结构,探索调控TAK1基因高水平转录的启动片段。方法利用生物信息学软件分析TAK1基因启动子结构,构建TAK1启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体,脂质体法转染滑膜成纤维样细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性。结果人TAK1基因-260~+25 bp片段具有高转录活性,明显高于其他片段,而-88~+25 bp启动子片段活性最低。结论人TAK1基因-260~-170 bp是主要的转录调控区,是进一步研究DNA结合蛋白的调控靶序列。     

PGC-1α协同ERRα在人肝癌细胞中调节小鼠SHP转录

目的 检测PGC-1α和ERRα在人肝癌细胞（HepG2）中对小鼠SHP转录的影响,鉴定ERRα调节SHP启动子利用的顺式元件。 方法 在HepG2细胞和人胚肾细胞（293A）中瞬时转染ERRα和/或PGC-1α,双荧光酶报告基因实验检测小鼠SHP启动子的活性。构建5′删切和顺式元件突变的启动子报告基因,结合HepG2细胞中的双荧光酶报告基因实验,检测ERRα作用的结合位点。 结果 在HepG2和293A细胞中,共表达ERRα和PGC-1α能促进SHP转录。分析SHP启动子序列发现5个潜在的ERRα结合位点。通过删切启动子5′端,筛选出其中3个元件参与SHP的转录调节。进一步突变以上3个结合元件,鉴定到其中2个位点参与PGC-1α协同ERRα调节SHP转录的过程,另一个位点参与了SHP基本水平的转录。 结论 在HepG2 细胞中,除核受体FXR、ERRγ之外,发现,ERRα可以作为调节SHP基因转录的新途径,但需共激活因子PGC-1α同时存在。     

PGC-1β调节大鼠ALAS-1基因表达机制的初步探讨

目的 检测PGC-1β在人肝癌细胞（Hep G2）和大鼠肝原代细胞中调节大鼠ALAS-1基因表达。方法 在Hep G2细胞中瞬时转染PGC-1β,用双荧光报告系统,检测过表达PGC-1β时,大鼠ALAS-1启动子报告基因的活性变化。同时构建了5'端顺式元件系列截短和突变的ALAS-1启动子报告基因,检测并分析介导PGC-1β作用的转录因子结合元件。分离肝原代细胞并检测PGC-1β对ALAS-1转录的影响。构建干扰NRF-1基因的siRNA腺病毒,证明,NRF-1介导PGC-1β激活ALAS-1启动子转录的作用。结果 在Hep G2细胞中,过表达PGC-1β显著促进ALAS-1表达。分别构建了FoxA2和NRF1结合元件突变的ALAS-1启动子,发现PGC-1β对NRF1突变的ALAS-1启动子的激活作用显著下降,而FoxA2作用不明显。在肝原代细胞中过表达PGC-1β促进了ALAS-1的转录。当用小RNA干扰NRF-1的表达后,则抑制了PGC-1β对ALAS-1转录的促进作用。结论 在Hep G2 和大鼠肝原代细胞中,PGC-1β能够促进ALAS-1基因的表达,并且这种作用是通过NRF-1介导完成的。     

人LAIR-1/CD305基因启动子的生物信息学分析

目的:研究人LAIR-1/CD305启动子及其5′上游调控序列。方法:通过检索NCBI中的人类基因组数据库,获得LAIR-1的转录本序列及翻译起始位点上游2500bp的序列。利用Promoter2.0等软件预测LAIR-1的启动子序列,然后利用MatInspector等软件对启动子序列的转录因子结合位点和启动子功能模块进行预测。结果:LAIR-1基因的核心启动子区位于翻译起始密码子上游的600～200bp区域内。在转录调控区发现了一些重要的转录因子结合位点,并预测到13种启动子功能模块。结论:LAIR-1基因的表达可能受到多种转录因子和5′端上游调控序列的调控。     

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

SREBP1c/cm对PERK启动子转录活性及表达的差异性调控

目的探讨转录因子固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)及其活性形式(SREBP1cm)对人蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)的调控作用。方法构建人PERK启动子截短体报告基因载体,与内参质粒pRL-SV40共转入人胚肾细胞HEK293检测荧光素酶活性;用pc DNA3.1(-)-SREBP1c、pc DNA3.1(-)-SREBP1cm与PERK启动子转录活性核心区域共转293T细胞,双荧光素酶报告基因分析SREBP1c及活性形式SREBP1cm对PERK启动子转录活性的调控;RT-PCR和免疫印迹法检测SREBP1c、SREBP1cm对PERK mRNA和蛋白表达的影响。结果成功构建PERK启动子截短体报告基因载体,确定了PERK启动子转录活性核心区域;双荧光素酶报告基因分析结果显示SREBP1c抑制PERK启动子的转录活性,而SREBP1cm促进PERK启动子的转录活性。SREBP1c抑制PERK mRNA和蛋白的表达(P0.05),SREBP1cm促进PERK mRNA和蛋白的表达(P0.05)。结论 SREBP1c和SREBP1cm对PERK启动子转录活性及其表达具有相反的调控作用。     

人B7H4启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

为构建人B7H4基因启动子荧光素酶报告基因载体,以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板,PCR扩增3条不同长度人B7H4启动子序列,并插入PGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中;待测序验证后,将3个重组质粒及pRL-TK内参质粒分别共转染HEK-293T细胞,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。测序结果显示构建的3个人B7H4基因启动子重组载体序列正确;重组载体转染HEK-293T细胞,经双荧光素酶报告基因检测确定重组载体有启动子活性,其中PGL3-hB7H4-0.5kb重组载体的转录活性较高。本研究成功构建了3条含不同长度的B7H4启动子序列的荧光素酶报告基因系统,为后续分析人B7H4启动子的转录调控元件及肿瘤微环境中调控B7H4表达的作用因素等研究奠定了实验基础。     

人大麻素受体启动子真核报告质粒的构建及活性分析

目的:利用双荧光素酶报告基因体系,根据大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,cnr1)启动子序列不同部位的转录活性来初步确定其活性区域,为脊髓缺血耐受保护中cnr1高表达的转录调控的研究奠定基础。方法:从NCBI中获取cnr1基因转录起始点5’端向上约1800 bp的核苷酸序列,按照300 bp的距离间隔,设计6个不同长度的截短体PCR引物,以人全血基因组DNA为模板,分别扩增cnr1启动子区域的截短体片段,并克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒中。将含有不同截短体的重组质粒分别转染Hela、Jurket和A549细胞后行荧光素酶活性检测。根据不同截短体转录活性检测结果,确定cnr1启动子活性区域。结果:成功将cnr1启动子区6个不同长度(1800、1500、1200、900、600和300 bp)的截短体克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒。在3种细胞系Hela、Jurket和A549的荧光素酶活性检测均显示600 bp的截短体转录活性最强。结论:成功构建了cnr1启动子的报告基因重组质粒,初步证实-600 bp到-200 bp区为cnr1的启动子的活性区域,从而为进一步研究cnr1的转录调控奠定了基础。     

AP-1在基因转录调控中的研究进展

AP- 1是一类二聚体的转录调控因子 ,其作用范围十分广泛 ,在基因转录的调控中有重要作用。 AP- 1对基因转录调控的作用是精细和复杂的 :首先 ,AP- 1家族各成员可以通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体 ,它们之间的不同比例就包含着不同的调控信息 ;其次 ,AP- 1可与其他蛋白因子协同作用共同决定 AP- 1发挥功能的特异性 ;最后 ,AP- 1序列结合的选择性低 ,因此 AP- 1可以结合在很多基因的不同启动子上对其转录进行调控 ,因而作用范围十分广泛。 AP- 1对基因的转录调控也是多层次的 :如多因子协同作用 ,以及细胞间对话均通过信号传导途经来实现     

SETD4对脂多糖诱导的AML12细胞IL-6转录的调控作用

目的　探讨SETD4（SET-domain containing protein 4）对脂多糖（LPS）诱导的AML12（小鼠肝脏细胞系）细胞IL-6的转录调控作用。 方法　构建SETD4表达质粒和IL-6 启动子荧光素酶报告基因质粒,共转染小鼠肝脏细胞系AML12,使用双荧光素酶报告基因技术检测LPS刺激后IL-6 启动子荧光素酶活性;单独转染SETD4表达质粒上调AML12细胞SETD4表达,检测LPS刺激后IL-6 mRNA水平变化。 结果　双酶切鉴定及核酸测序证实重组质粒pcDNA3.0/HA-SETD4、pGL3.0/IL-6 promoter的构建成功。pcDNA3.0/HA-SETD4与pGL3.0/IL-6 promoter共转染AML12细胞,LPS刺激后SETD4对IL-6 启动子荧光素酶活性没有影响;上调SETD4表达后,可以促进LPS诱导的IL-6 mRNA转录。 结论　成功构建SETD4真核表达质粒和IL-6启动子荧光素酶报告基因质粒;SETD4对LPS诱导的AML12细胞IL-6的转录发挥正调控作用。     

热休克因子1对FasL的调控作用

目的研究人热休克因子l（HSFl）对Fas配体（FasL）启动子转录活性的影响。方法用在线启动子分析软件分析FasL启动子区转录因子结合位点;凝胶阻滞实验（EMSA）研究内源性HSFl与FasL启动子区的热休克元件（HSE）结合能力;将组成型活化的HSFl突变体与FasL启动子表达载体FasL—luc共同转染HeLa细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测荧光索酶活性。结果在FasL启动子区发现HSE核心序列（nGAAnnTYCn）,HSFl可以与该HSE体外结合;荧光素酶活性测定发现HSFl明显上调FasL—luc转录活性,突变该HSE,则转录激活作用消失。结论HSFl对FasL具有转录调控作用。     

鼻咽癌STGC3基因转录调控元件分析与鉴定*

目的：分析并鉴定STGC3基因转录调控元件,探讨鼻咽癌STGC3基因的转录调控分子机制。方法：运用 生物信息学,预测并分析STGC3基因核心启动子区的转录因子结合位点;将相关转录因子结合位点,制备3 种探 针即生物素标记野生型、突变型及未标记野生型;提取CNE2细胞核蛋白,利用电泳迁移率变动分析（ EMSA） 及染色质免疫共沉淀（ ChIP）分析,体内外鉴定转录因子结合位点。结果：在STGC3基因核心启动子区存在21 个转录因子结合位点,其中9 个为Sp1 转录因子结合位点;进一步严格限定参数,STGC3基因核心启动子区域含 有转录因子结合位点5 个,其中Sp1 转录因子结合位点2 个;EMSA和ChIP 实验结果显示,STGC3基因中存在转 录因子Sp1 特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。结论： STGC3基因核心启动子区含有Sp1 特异性结合位点,为该基因的转录调控元件。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

c-Jun对硫氧还蛋白还原酶1启动子转录的调控作用

目的: 探讨转录因子激活剂蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族成员c-Jun对硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1, TrxR1 )启动子转录的调控作用。方法: 利用生物信息学技术分析调控 TrxR1 启动子区域的转录因子,构建 TrxR1 启动子区域一系列截短的萤光素酶报告基因载体,将含c-Jun的真核表达载体pcDNA3.1(+)-c-Jun和含有 TrxR1 启动子的萤光素酶报告基因载体共转染人胚肾HEK293细胞和鼠心肌H9c2细胞,检测转染细胞中萤光素酶活性。应用定点突变技术针对 TrxR1 启动子区域AP-1的可能结合位点进行突变,与c-Jun的真核表达载体共转染上述2种细胞,检测各组萤光素酶活性。利用染色质免疫共沉淀(ChIP),分析c-Jun与 TrxR1 启动子区域的AP-1结合位点结合情况。结果: 酶切及测序结果表明,获得的3个不同长度的 TrxR1 启动子克隆与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确;此3种质粒都有明显的启动子活性,在人胚肾HEK293和鼠心肌H9c2细胞中转染pcDNA 3. 1(+)-c-Jun可以上调 TrxR1 启动子活性。突变AP-1结合位点,导致 TrxR1 启动子活性明显降低;ChIP结果显示c-Jun结合在 TrxR1 启动子区域的AP-1结合位点上。结论: 转录因子AP-1家族成员c-Jun可能通过与 TrxR1 基因启动子区域AP-1结合位点相结合,上调 TrxR1 基因的转录。     

干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)启动子上所含的干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.     

全反式维甲酸诱导小鼠碱性磷酸酶基因启动子区染色体重构

背景：碱性磷酸酶基因是成骨细胞分化和骨形成的重要标志。在C3H10T1/2细胞中,全反式维甲酸可通过核受体上调小鼠碱性磷酸酶的表达,与MAPK通路无关。 目的：从染色体结构调控方面揭示全反式维甲酸上调碱性磷酸酶表达的分子机制。 方法：10^-6 mol/L全反式维甲酸处理C3H10T1/2细胞0,1,6,12 h,DNA酶Ⅰ超敏感实验确定全反式维甲酸调控区域的位置,染色质免疫共沉淀实验检验全反式维甲酸处理细胞后一系列转录相关因子与全反式维甲酸调控区域结合的量效关系以及时相分布。 结果与结论：DNA聚合酶Ⅰ超敏感实验表明,小鼠碱性磷酸酶启动子转录起始位点上游约520 bp附近为潜在的全反式维甲酸调控区域;染色质免疫共沉淀实验表明,全反式维甲酸对小鼠碱性磷酸酶的上调作用是通过一系列转录相关因子的时序性共同作用来实现。表明全反式维甲酸诱导小鼠碱性磷酸酶基因转录的过程中伴随着染色质重构和组蛋白的修饰作用。     

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用.方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrin mRNA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69.结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrin mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性.Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性.结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达.     

人类XBP1基因5′上游DNA序列的转录激活功能分析

目的分析人类转录因子X-盒结合蛋白1（X-box binding protein Ⅰ，XBP1）基因启动子在不同细胞系中转录活性的差别，研究其转录调控机制。方法在对XBP1基因进行生物信息学分析的基础上，设计6种XBP1启动子缺失突变体，分别包括剧XBP1基因5’上游-1039～66bp、-859～66bp、-623～66bp、-351～66bp，-227—66bp、-227～-45bp，针对每一种缺失突变体构建相应的氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltansferase，CAT）报告基因载体，再分别瞬时转染K562、HepG2、NIH-3T3和LO2细胞，应用报告基因CAT瞬时表达系统，检测XBP1每一种缺失突变体在K562、HepG2、NIH-3T3和LO2 4种不同细胞中的活性差异，并进一步确定脚，基因启动子的具体调节部位。结果成功获得XBP1基因启动子6种缺失突变体的正确克隆和6种相应的报告基因载体p1—XBP1p，p2-XBP1p，p3-XBP1p，p4-XBP1p，p5-XBP1p，p6-XBP1p，每一种报告基因转染K562、HepG2、NIH-313和LO2 4种不同细胞系后，p4-XBP1p和p5-XBP1p在K562、HepG2细胞中的转录活性均高于其它报告载体，p5-XBP1p在HepG2细胞中转录活性最高；而6种报告基因载体在NIH-3T3小鼠成纤维细胞中不具有转录活性。结论。XBP1基因的转录激活能力在不同细胞中有所差异，其表达活性具有一定的细胞类型特异性，与细胞类型和细胞状态密切相关；XBP1基因启动子的-227～66bp区域是该启动子的核心部位，而且核心启动子区包括ATG翻译起始密码子的下游部位，这一部位是转录活性的重要部位，一旦缺失，XBP1基因启动子会丧失活性。     

HTLV-1 Tax 蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（human T-cell leukemia virus 1,HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（ high mobility group box 1,HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质,通过real-time PCR和Western blot分析HMGB1 mRNA和蛋白质的表达情况;利用脂质体介导方法,将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN 和 TaxP 细胞,观察 HMGB1基因在不同 T 细胞中的转录活性;pCMV-Tax 与 pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞,观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响;染色体免疫共沉淀（ ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果 TaxP细胞中HMGB1 mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。 TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似,均表现出3号质粒（pHLuc3,含有-504～＋83 HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1/neo）最高,但是6号质粒（含有-1163～＋83 HMGB1区段）却表现出 TaxP 细胞 HMGB1的转录活性明显高于 TaxN 细胞。pCMV-Tax与pGL3-HMGB1-Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示,6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。 ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段。结论-504～-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区,Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。     

大鼠GLUT3启动子的克隆及其缺糖调控活性的测定

目的: 构建葡萄糖转运体3(GLUT3)启动子的报告基因,并在正常和缺糖情况下检测其转录活性。方法: 使用生物信息学软件预测了GLUT3 的启动子序列,长度1 292 bp, 包含第1个外显子, 通过PCR及双酶切方法,从大鼠全血基因组DNA中获得GLUT3 基因编码序列, 包含GLUT3 启动子序列,然后克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建GLUT3 启动子的报告基因;用脂质体转染法将pGL3-GLUT3与胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(pRL-TK)共转染入PC12细胞中,以pRL-TK载体作内参照,分别给予正常和缺糖培养,采用双萤光素酶报告系统评估GLUT3 启动子的活性。结果: 经PCR方法扩增出GLUT3 启动子序列,测序与GenBank序列一致;转染后检测显示,该pGL3-GLUT3明显具有转录活性,而且在缺糖24 h情况下其双萤光素酶活性有明显升高。结论: 成功构建出GLUT3 启动子报告基因,pGL3-GLUT3表现出很好的缺糖诱导活性,缺糖24 h是研究pGL3-GLUT3在缺糖情况下转录调控很有意义的时间点。