抗柯萨奇病毒A组10型中和抗体检测用毒株的应用研究

目的 研究抗柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）中和抗体检测用毒株的应用。方法 对CV-A10毒株进行扩增培养,建立3级种子批并进行相关检定。采用3人3次独立测定病毒滴度,对工作种子批进行滴度标定,通过分别与肠道病毒71型（enterovirus A71,EV-A71）、CV-A16、CV-A6免疫血清进行交叉中和反应,评价该毒株的专属性。对CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清样品进行中和抗体效价检测,对其应用进行评价研究。结果 获得一株CV-A10中和抗体检测用毒株,3级种子批的无菌检查、支原体检查等项目均符合中国药典2020年版三部相关要求;经标定,平均病毒滴度为7.903 lg半数细胞培养物感染量（50% cell culture infectious dose,CCID₅₀）/ml（95%置信区间：7.868~7.937 lgCCID₅₀/ml）,变异系数为1.10%;与EV-A71、CV-A16、CV-A6免疫血清无交叉反应,专属性良好;检测CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清,中和抗体的最大值与最小值倍数差均小于4,中和抗体检测变异系数分别为6.38%和3.64%。结论 抗CV-A10中和抗体检测用毒株具有较好的专属性可很好的应用于后续抗CV-A10中和抗体的相关检测。     

新型冠状病毒受体结合域-Fc融合蛋白表达及小鼠免疫原性

目的  表达制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域（receptor binding domain,RBD）-Fc融合蛋白,并评价其在小鼠模型中的免疫原性。方法  将新型冠状病毒RBD与小鼠免疫球蛋白Fc段融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中融合表达并制备融合蛋白。将不同剂量的RBD-Fc融合蛋白分别单独或辅以氢氧化铝佐剂免疫小鼠,通过ELISA、假病毒中和试验、酶联免疫斑点试验检测诱导产生的体液和细胞免疫应答。结果  10 μg RBD-Fc融合蛋白辅以氢氧化铝佐剂能有效诱导小鼠产生良好的RBD特异性IgG抗体应答,该抗体可阻断病毒RBD与细胞表面病毒受体的结合,进一步研究表明该重组蛋白还诱导产生了针对原始毒株、Beta变异株和Delta变异株假病毒的中和抗体,中和抗体滴度分别为1 566、336和270。结论  制备的RBD-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性,可为开发COVID-19重组蛋白疫苗提供参考。     

兔抗肠道病毒71型血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响

目的 研究兔抗肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响。方法 将9只实验兔简单随机分为3组,每组3只。5、50和100 μg 3个剂量EV71灭活疫苗和弗氏佐剂均匀混合后,通过肌内注射途径分别免疫3组动物,于第0、7、14及28天各免疫1次,每7天采血,分离血清,检测抗EV71中和抗体效价。结果 100 μg剂量组兔血清抗体效价显著高于5和50 μg剂量组（第42天t值分别为–3.282和–2.486,P值均<0.05）。第42天时,兔血清抗体效价和免疫剂量（5~100 μg范围内）呈线性关系,回归方程y=478.229x–2 041.820。结论 在本实验选择的3个免疫剂量中,随着免疫剂量升高,产生的血清抗体效价也升高,且呈线性关系。     

抗新型冠状病毒卵黄抗体对病毒及变异株的体外中和作用

目的 研究抗新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin，IgY）在体外对SARS-CoV-2及其变异株的中和抑制作用，探讨其作为鼻腔/口腔喷雾剂用于预防和阻断SARS-CoV-2感染的可能性。方法 采用间接ELISA检测抗SARS-CoV-2 IgY原液及成品对刺突（spike，S）蛋白的抗体效价；用微量细胞病变法检测其对SARS-CoV-2的中和活性；用萤光素酶发光法检测其对SARS-CoV-2假病毒的中和作用。结果 抗SARS-CoV-2 IgY原液的抗S抗原效价为1:32 000~1:64 000，成品的效价为1:16 000~1:32 000；两批原液对活病毒的中和效价分别为1:128和1:256，相应的抑制中浓度（median inhibitory concentration，IC₅₀）分别为36.22和36.50 μg/ml；成品对SARS-CoV-2假病毒的IC₅₀均值分别为4.571 μg/ml（WT）和6.07 μg/ml（D614G）；对变异株假病毒的IC₅₀分别为15.09~29.94 μg/ml（B.1.1.7）、41.71~55.56 μg/ml（B.1.351）和16.66~32.33 μg/ml（B.1.617.2）。结论 抗SARS-CoV-2 IgY与SARS-CoV-2重组S蛋白具有良好的结合活性，在体外能显著地中和SARS-CoV-2活病毒、假病毒及变异株假病毒，有望用于SARS-CoV-2感染的预防和阻断。     

基于仓鼠模型的新型冠状病毒抗体依赖性感染增强研究

目的   利用仓鼠模型探究新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染后是否存在抗体依赖性感染增强（antibody-dependent enhancement,ADE）现象,为疫苗研发和接种提供实验依据。方法   实验室构建SARS-CoV-2感染仓鼠模型,分成对照组、感染组、二次感染组、免疫组,ELISA法检测仓鼠血清总抗体以及细胞因子IL-6和转化生长因子-β含量;中和试验法检测仓鼠血清病毒中和抗体;免疫印迹法和定量逆转录PCR检测仓鼠肺组织病毒含量;苏木精-伊红染色法观察仓鼠肺组织病理变化;分离培养仓鼠腹腔原代巨噬细胞,检测仓鼠免疫血清能否促进SARS-CoV-2对巨噬细胞的感染。结果   二次感染组和免疫组仓鼠血清总抗体滴度差异无统计学意义（P>0.05）;但免疫组中和抗体水平显著低于二次感染组（P<0.001）;与感染组相比,二次感染组和免疫组仓鼠感染病毒后体质量保持稳定（P<0.01）,肺组织炎症反应轻,仅免疫组在感染后第2天的肺组织中检出病毒;各组仓鼠血清中促炎因子IL-6和抗炎因子转化生长因子-β的含量差异无统计学意义（P>0.05）;在有或无仓鼠免疫血清的条件下,SARS-CoV-2均不能感染仓鼠腹腔巨噬细胞,但可被吞噬。结论   基于仓鼠感染模型的初步实验结果,不支持SARS-CoV-2感染中存在巨噬细胞介导的ADE现象。     

重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的  在毕赤酵母细胞中稳定表达经连接肽连接的HBsAg和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白（glycoprotein,g）E的重组蛋白,并进行初步纯化及颗粒性验证。方法  构建HBsAg-gE的四拷贝重组表达质粒,经酶切线性化后电转化至毕赤酵母KM71细胞中,甲醇诱导表达。采用免疫印迹法和ELISA检测表达的重组蛋白,经蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析初步纯化后进行透射电子显微镜观察。结果  HBsAg-gE四拷贝重组质粒经双酶切鉴定正确。表达的重组蛋白经免疫印迹法检测,可以与小鼠抗gE单克隆抗体及抗HBsAg多克隆抗体特异性结合,相对分子质量约90 000。经ELISA检测HBsAg呈阳性。蔗糖密度梯度离心后,重组蛋白聚集在40%至55%区带之间,在透射电子显微镜下观察到直径约20 nm左右的病毒样颗粒结构。结论  成功在毕赤酵母中表达了HBsAg-gE病毒样颗粒,为在酵母系统中表达水痘-带状疱疹重组疫苗奠定了基础。     

Vero细胞洗换方式对轮状病毒活疫苗收获液的影响

目的  探讨Vero细胞洗换方式对口服六价轮状病毒活疫苗收获液的影响。方法  采用3种不同方式洗换Vero细胞后,观察相应的致细胞病变效应,使用ELISA检测洗换前后牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）残留、快速荧光灶法检测收获液病毒滴度,并测定病毒收获液浊度及粒径,比较3种洗换方式的差异。结果  使用方式1、2、3洗换后,方式1、2致细胞病变进程明显较方式3快;收获液BSA残留（均值±标准差）分别为（15.0±4.1）、（16.3±4.0）、（52.6±4.7） ng/ml,方式1、2较方式3收获液BSA残留明显下降;方式1、2、3洗换的收获液病毒滴度分别为（7.27±0.06）、（7.23±0.06）、（6.97±0.06） lg荧光灶单位/ml,方式1、2较方式3收获液病毒滴度明显上升。不同洗换方式处理后,病毒收获液浊度和粒径的差异无统计学意义。方式1、2、3处理后,病毒收获液BSA残留、病毒滴度、浊度与粒径均符合标准。结论  结合实际生产条件,滴度较高、BSA含量较低的方式1适合作为后续的大规模原液制备过程中的洗换方式。     

布鲁菌Tb噬菌体效价噬斑测定法的建立

 目的  建立标准化的布鲁菌Tb噬菌体效价噬斑测定方法。方法  通过比较单层琼脂平板法与双层琼脂平板法,对宿主菌接种浓度、吸附时间及培养时间等参数,标准化布鲁菌Tb噬菌体效价测定方法,并分析其精密性。结果  虽然两种方法测定的噬菌体结果无差别,但双层琼脂平板法的噬斑背景背景更清晰,易于结果观察。经优化后确定布鲁菌Tb噬菌体效价测定条件：宿主菌的最适接种浓度为1.0×10⁹ ml^-1,宿主菌与噬菌体混合后不需吸附,培养3~5 d后进行噬菌斑计数。建立的标准检测方法具有较好的精密性。结论  建立了布鲁菌Tb噬菌体效价噬菌斑测定方法,为布鲁菌Tb噬菌体及布鲁菌活疫苗质量控制奠定了基础。     

红细胞分散对奥沙利铂体外溶血试验的影响研究

目的： 通过分散红细胞改良体外溶血试验方法,探索奥沙利铂临床与非临床相一致的溶血性结果。方法： 在标准的体外溶血试验方案基础上,通过改变反应介质考察奥沙利铂的溶血结果;显微镜观察各试验方法中的红细胞分布,探索不同介质下体外溶血试验机制;酶标仪检测溶血试验试管中上清液吸光度计算溶血率;通过温和摇晃方式改变奥沙利铂对红细胞的药物暴露。结果： 以葡萄糖作为体外溶血试验介质时多类溶血制剂药物产生假阴性结果,在体外溶血试验中葡萄糖介质内红细胞发生细胞间黏附、聚集成团现象;通过持续温和摇晃方法,以葡萄糖为介质的奥沙利铂体外溶血试验产生阳性结果。结论： 体外溶血试验使用葡萄糖为实验介质时,可以通过温和分散红细胞的方式充分暴露奥沙利铂与红细胞的接触,展示更为客观的溶血实验结果。     

口服六价重配轮状病毒活疫苗毒种的传代遗传稳定性

目的 研究口服六价重配轮状病毒减毒活疫苗毒种的传代遗传稳定性,确保毒种能在传代过程中稳定遗传。方法 将建立的主种子批传代扩增制备新的工作种子批,用于规模化生产各血清型原液。原液传代至疫苗代次后第6代（P6）。对各血清型工作种子批、2批原液及P6,按照企业自建标准及中国药典2020年版三部通则规定的鉴别试验、病毒滴度测定、无菌检查、支原体检查、外源因子检查及遗传稳定性研究等方法进行检定。提取样品总RNA进行高通量测序,测定单核苷酸多态性及注释。分析传代过程中病毒滴度的变化及各血清型VP7、NSP4蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果 口服六价重配轮状病毒减毒活疫苗工作种子批、原液及P6的支原体、无菌和外源因子检查结果均为阴性。各血清型工作种子批和P6病毒滴度在6.4~8.1 lg荧光转化灶/ml,原液病毒滴度在7.8~9.0 lg荧光转化灶/ml。G1—G4、G8血清型各样品VP7核苷酸和氨基酸序列的同源性均为100%。G9血清型同源性分别为99.9%和99.7%。各血清型样品NSP4核苷酸和氨基酸序列同源性均高于99.8%,且氨基酸突变位点均不在NSP4肠毒素活性区。结论 口服六价重配轮状病毒减毒活疫苗生产用毒种具有良好的传代稳定性,可用于大规模生产。     

聚乙二醇化胰高血糖素样肽1类似物生物学活性的报告基因法测定

 目的  建立检测聚乙二醇化胰高血糖素样肽1类似物（polyethylene glycolylated  glucagon like peptide -1 analogue,PEG-GLP-1a）生物活性的报告基因法,并对该方法进行验证。 方法 将人胰高血糖素样肽1受体表达载体和分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase, SEAP）报告基因载体瞬时共转染HEK293T细胞,培养后加入PEG-GLP-1a刺激细胞分泌SEAP,使用SEAP报告基因检测试剂盒进行测定,并验证其专属性、准确性、精密度、稳定性等指标。 结果  人胰高血糖素样肽1受体和SEAP双载体瞬时共转染的HEK293T细胞对PEG-GLP-1a具有强反应性。使用该方法测定PEG-GLP-1a具有良好的专属性。加标回收率为97.6%~102.23%,准确性较好。不同测定日期的日内半数效应浓度的变异系数都小于10.22%,不同测定日期的日间半数效应浓度的变异系数都小于13.02%。 结论  报告基因法可以用于PEG-GLP-1a的生物活性检测。     

喷雾式添加氨水对氢氧化铝佐剂质量一致性的影响

目的  通过喷雾式添加氨水制备氢氧化铝佐剂,分析其对佐剂质量批间一致性的影响。 方法  分别以喷雾和流加方式添加氨水至三氯化铝溶液各制备3批氢氧化铝佐剂,比较两种氨水添加工艺制备的佐剂粒径、pH、外观等质量指标。 结果  喷雾方式添加氨水制备的3批佐剂平均粒径为（96.7±8.6） nm,pH为4.93±0.02,透析后沉淀量为（20.9±0.4） g/L;流加方式添加氨水制备的3批佐剂平均粒径为（161.0±24.7） nm,pH为4.85±0.06,透析后沉淀量为（105.6±13.8） g/L。相较于流加,以喷雾式添加氨水制备的3批佐剂为均一的乳白色悬液,粒径更小,透析后透析袋底部大颗粒沉淀明显减少,批间一致性更好。 结论  采用喷雾方式将氨水加入三氯化铝溶液中,可使氨水与三氯化铝溶液接触更加充分,产物更加均匀,有助于提高氢氧化铝佐剂外观、粒径、pH等质量指标的批间一致性。     

ELISA检测庆大霉素残留量数据拟合模型的探讨

目的 探讨ELISA检测乙型脑炎减毒活疫苗中庆大霉素残留量的数据拟合模型,以验证和优化定量检测系统。方法 采用商品化庆大霉素残留酶联免疫检测试剂盒对乙型脑炎减毒活疫苗进行庆大霉素残留量检测,通过二次多项式模型、对数线性模型和四参数logistic模型对实验数据进行拟合处理,分析比较各模型的决定系数（R²）、实验点分布、回收率等指标。结果 二次多项式模型、对数线性模型和四参数logistic模型的变量显著性检验均有统计学意义（P<0.05）,R²均值分别为0.997 0、0.994 4、0.999 3,二次多项式模型和四参数logistic模型拟合优度较好;各拟合模型的标准品实验点在标准曲线两侧的分布都较为均匀,四参数logistic模型最佳,尤其是在中、低浓度范围（0.1~0.9 ng/ml）;各拟合模型在0.1～8.1 ng/ml浓度范围的标准品回收率均达到中国药典要求,且差异无统计学意义。结论 二次多项式模型、对数线性模型和四参数logistic模型均适用于ELISA检测庆大霉素残留量的数据分析,其中二次多项式模型和四参数logistic模型拟合较好,这对持续优化该项定量检测具有重要指导意义。     

疫苗0～2 ℃储存挑战性实验

目的  探讨冻干制剂乙型脑炎减毒活疫苗和液体制剂23价肺炎球菌多糖疫苗0～2 ℃条件下存放对其效价的影响。方法  将冻干制剂乙型脑炎减毒活疫苗和液体制剂23价肺炎球菌多糖疫苗存放于0～2 ℃条件下一定时间后,与存放于2～8 ℃规定条件的制品进行疫苗效价的比较。结果  1人份和5人份乙型脑炎减毒活疫苗在0～2 ℃条件下分别存放17 h 20 min和18 h 55 min,病毒滴度均符合5.7～7.1 lgPFU/ml的质量标准,且与存放于2～8 ℃规定条件的同批次疫苗比较,t值分别为0.26和0.28,P值均大于0.05,差异无统计学意义;23价肺炎球菌多糖疫苗在0～2 ℃条件下存放21 h 50 min,23个型别的多糖含量均符合35～65 μg/ml的质量标准,且与存放于2～8 ℃规定条件的同批次疫苗比较,t值为0.01~2.25,P值均大于0.05,差异无统计学意义。结论  冻干制剂乙型脑炎减毒活疫苗和液体制剂23价肺炎球菌多糖疫苗存放在0～2 ℃条件下的一定时间内,疫苗效价仍符合质量标准。     

静注人免疫球蛋白治疗新型冠状病毒肺炎的Meta分析

目的   通过Meta分析明确静注人免疫球蛋白（human immunoglobulin for intravenous injection,IVIG）对于新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的疗效和安全性。方法 计算机检索Cochrane图书馆、PubMed、中国期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库自2020年1月1日至2021年7月31日发表的关于IVIG治疗COVID-19的中、英文随机对照试验及队列研究。根据Cochrane系统评价员手册进行质量评价,采用RevMan 5.3软件进行Meta分析。结果 共纳入11个符合标准的临床研究,包含4个随机对照试验和7个队列研究。Meta分析结果发现：IVIG能显著降低危重型COVID-19患者的死亡率〔相对危险度（RR）=0.67,95%置信区间（CI）：0.52~0.85,P=0.001,I²=7%〕;在重型患者中,IVIG也能带来潜在的生存率改善,但差异无统计学意义〔RR=0.78,95% CI：0.52~1.18,P=0.24,I²=49%〕。IVIG在COVID-19患者中的不良反应发生率在0.0%~5.9%之间,以轻至中度不良反应为主,表现为心悸、头晕、皮疹、注射部位水肿等。结论   IVIG安全性良好,能显著提高危重型COVID-19患者生存率。在重型患者中需进一步探索IVIG的使用时机和推荐剂量,以更好地指导临床治疗。     

联合酶联免疫的微量病毒中和法检测大流行流感疫苗血清中和抗体的可行性研究

目的:建立联合酶联免疫的微量病毒中和法(ELISA-MVN法),用于大流行流感疫苗流感病毒中和抗体效价的检测,并进行方法学验证。方法:采用4种羊抗流感病毒血清参考品,与人感染禽流感H5N1病毒疫苗株(A/Vietnam/1194/2004-NIBRG-14)病毒液,分别于37℃孵育18 h后,固定细胞,ELISA检测细胞内流感病毒核蛋白表达,确定其中和抗体效价,考察该方法的特异性;通过对高中低不同抗体滴度的血清样本的多次平行检测来评价该方法的重复性;通过ELISAMVN法和血凝抑制试验(HI试验)分别检测大流行流感疫苗接种者血清样本,比较2种方法的灵敏性和相关性。结果:ELISA-MVN结果显示羊抗H5N1的血清中和抗体检测滴度为5 120,其他3种血清的中和抗体滴度小于10,该方法特异性良好;采用ELISA-MVN法对3种不同滴度的血清进行重复检测,组内重复性试验的6次平行试验结果的RSD为3.5%。组间重复性5次结果,RSD为4.8%~8.6%。2种方法测定疫苗接种者血清样本抗体效价的结果具有显著相关性(P<0.001),相关系数r=0.932。ELISA-MVN法检测结果的几何平均滴度高于HI试验检测结果,该方法较HI试验在检测大流行流感疫苗血清样本灵敏度高。结论:ELISA-MVN可满足大流行流感疫苗血清学检测的要求,并可用于评价大流行流感疫苗的免疫效果。     

人凝血因子Ⅷ的溶血性和血管刺激性研究

目的  评估人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ,hFⅧ）的溶血性和血管刺激性。方法  以家兔为实验动物,对hFⅧ进行体外溶血和体内血管刺激性实验。结果  在3 h体外实验期间未观察到兔红细胞发生溶血和凝聚。当以40 IU/kg 剂量的hFⅧ对家兔进行静脉注射时,未观察到家兔耳缘静脉的血管刺激性反应。结论  静脉注射推荐剂量的hFⅧ不会发生溶血和血管刺激反应。     

甲醛溶液对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活效果研究

 目的  验证4%甲醛溶液使Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎（脊灰）病毒达到预期灭活效果所需要的时间。方法  用4%甲醛溶液对15批Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒在(36.5±1) ℃ 环境进行灭活,同时以15批未加入4%甲醛溶液的病毒纯化液作为对照组,按照企业注册标准采用微量细胞病变法测定病毒滴度。为了消除4%甲醛溶液对Hep-2细胞的影响,取4%甲醛溶液接种Hep-2细胞作为实验组,同时设置Hep-2细胞为对照组,每天观察对比两组细胞形态。对同一个Hep-2细胞悬液的总细胞数和活细胞数采用传统手工计数和全自动细胞计数仪计数,并比较分析结果。结果  实验组随着灭活时间的延长病毒滴度呈下降趋势,在灭活到第4天起,3个型别样品均检测不到病毒滴度;对照组病毒滴度在每毫升9.1～10.6 lg半数细胞培养物感染量范围内,符合企业注册标准的要求。4%甲醛溶液对Hep-2细胞生长有抑制作用,在培养观察到第3天时细胞全部失去活力死亡;对照组细胞形态良好呈多边形长成致密单层,活细胞组t值为18.098,总细胞组t值为4.005,P值均＜0.05,差异有统计学意义。结论  脊灰病毒在第4天能被彻底灭活,在进行此实验时应先消除甲醛对细胞培养的影响,避免结果出现假病变现象,确保结果的准确性;应用全自动细胞计数能提高计数结果的精确度。     

2015—2019年西双版纳傣族自治州流行性腮腺炎流行特征分析

目的 分析2015－2019年西双版纳傣族自治州（西双版纳）流行性腮腺炎的流行特征,为进一步预防控制流行性腮腺炎提供参考依据。方法 对2015－2019年中国疾病预防控制信息系统报告的流行性腮腺炎病例和暴发疫情资料进行描述性分析。结果 西双版纳2015－2019年共报告2 452例流行性腮腺炎,年平均报告发病率为41.87/10万;男、女性报告发病率比为1.16:1.00;夏冬季为高发季节;0~14岁人群发病率最高（154.39/10万）;总病例的64.23%为学生,7次暴发疫情均发生于学校。2015－2019年共接种136 433剂次含腮腺炎成分疫苗,其中104 133剂次麻疹-腮腺炎-风疹联合疫苗,其余为腮腺炎疫苗。结论 2015－2019年西双版纳流行性腮腺炎发病率呈上升趋势,建议完善麻疹-腮腺炎-风疹联合疫苗儿童免疫规划,提高疫苗接种覆盖率,做好学校晨检工作,加强预防接种证查验工作和流行性腮腺炎的主动监测。