胃癌中RNA甲基化酶NSUN2的表达及其临床意义

目的探讨胃癌中RNA甲基化酶NSUN2的表达及其临床意义。方法收集109例胃癌采用免疫组化SP法检测癌组织及对应癌旁组织中NSUN2的表达,并分析NSUN2表达与临床病理特征及预后生存时间的关系。利用qRT-PCR及Western blot法检测20对新鲜冷冻胃癌组织及对应癌旁组织中NSUN2的表达。结果 NSUN2在胃癌组织的高表达率为65.1%(71/109),在癌旁组织中的高表达率为15.6%(17/109),两组差异有统计学意义(P0.05)。qRT-PCR和Western blot证实NSUN2 mRNA在胃癌组织中高表达。胃癌中NUSN2高表达与淋巴结转移、浸润深度、远端转移、脉管浸润、神经侵犯、临床分级、TNM分期及患者预后生存时间明显相关(P0.05);与患者年龄、性别、肿瘤位置和直径无关(P0.05)。结论 NSUN2表达与胃癌TNM分期和侵袭性显著相关,NSUN2表达影响患者预后,NSUN2对于胃癌诊断和预后的评判具有一定的价值。     

miR-483-5p通过上调IGF2基因转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭

目的:探讨miR-483-5p对人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因P3启动子驱动的m RNA(P3 m RNA)表达的影响及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法:(1)采用real-time PCR检测人肝癌细胞株Huh7、Hep3B、Bel-7402、Hep G2和SMMC-7721,人正常肝细胞株HL-7702,83例人肝细胞癌组织和配对的癌旁组织,22例正常肝组织中miR-483-5p和P3 m RNA的表达水平,并应用Pearson相关分析评估P3 m RNA与miR-483-5p表达水平之间的关系。(2)将IGF2基因P3 m RNA的5’端非翻译区(5’UTR)克隆入p GL3启动子载体,构建P3 m RNA 5’UTR野生型(p GL3-P3-5’UTR-WT)及P3 m RNA 5’UTR突变型(p GL3-P3-5’UTR-MUT)重组萤光素酶报告质粒,将其分别与miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control共转染He La、293T及Huh7细胞,采用双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性。(3)分别将miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control转染Huh7及Hep3B肝癌细胞,应用real-time PCR检测这2种肝癌细胞P3 m RNA表达水平的变化。(4)应用real-time PCR检测肝癌细胞Huh7及Hep3B的细胞核和细胞质中miR-483-5p的表达水平;应用核连缀实验(nuclear run-on assay)分析miR-483-5p对P3 m RNA转录的影响;应用RNA稳定性实验分析miR-483-5p对P3 m RNA稳定性影响。(5)应用体外细胞功能实验研究miR-483-5p对Huh7肝癌细胞生长、凋亡、迁移与侵袭能力的影响。结果:(1)5种肝癌细胞株miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于正常肝细胞株HL-7702(P0.01),肝细胞癌组织中miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于配对的癌旁组织及正常肝组织(P0.01);线性相关分析显示,在5种肝癌细胞株及肝细胞癌组织中,P3 m RNA表达水平均与miR-483-5p水平呈正相关。(2)萤光素酶实验显示,miR-483-5p与P3m RNA 5’UTR的同源位点互补结合可促进P3 m RNA的表达。(3)瞬时转染实验显示,过表达miR-483-5p呈剂量依赖性促进Hep3B和Huh7肝癌细胞P3 m RNA表达水平的增高。(4)miR-483-5p表达实验显示,成熟miR-483-5p存在于肝癌细胞Hep3B和Huh7的细胞质和细胞核中;核连缀实验显示,miR-483-5p诱导Huh7肝癌细胞核中新生P3 m RNA转录;RNA稳定性实验表明,miR-483-5p不改变Huh7肝癌细胞P3 m RNA稳定性。(5)体外细胞功能实验显示,miR-483-5p促进Huh7肝癌细胞增殖,抑制其凋亡,并增强迁移与侵袭能力。结论:miR-483-5p高表达可部分通过上调IGF2基因P3 m RNA转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭,进而参与肝细胞癌发生。     

原发性肝癌组织中Survivin和Cox-2的表达及其相关性

目的:探讨凋亡抑制蛋白存活素(Survivin)和环氧化酶-2(Cox-2)在原发性肝癌组织中的表达以及两者之间的相关性。方法:用免疫组化SP法对41例原发性肝癌组织标本Survivin和Cox-2的表达进行检测。结果:41例肝癌组织中Survivin和Cox-2的阳性表达率分别是48.78%(20/41)和70.73%(29/41),均与患者的年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05),但与肿瘤的淋巴结转移有关(P<0.05),两者在有淋巴结转移组的表达率明显高于无转移组(P<0.05);相关分析发现Sur-vivin和Cox-2在肝癌组织中的表达呈显著正相关(r=0.413,P<0.05)。结论:Survivin和Cox-2在原发性肝癌组织中的阳性表达与其生物学特性有关,两者对肝癌的发生发展存在协同作用。     

CUEDC2在肝细胞癌组织中的表达及其临床预后的意义

目的:检测含CUE结构域蛋白2(CUEDC2)在肝细胞癌组织中的表达,探讨其与临床预后的关系。方法:选取具有完整临床及预后资料的186例手术切除肝细胞癌组织的石蜡组织标本,采用免疫组化技术检测CUEDC2的表达,并结合肝癌临床病理因素及预后进行分析。结果:CUEDC2在85.5%(159/186)的肝癌组织中有表达,其中低表达为52.2%(97/186),高表达为47.8%(89/186);CUEDC2的表达状态与血清甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤大小、肿瘤数目、肝癌分化程度和TNM分期有关(P0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示CUEDC2高表达的患者术后总生存及无复发生存期较低表达者显著缩短;多因素Cox回归分析显示CUEDC2的表达状态、血清AFP和肿瘤数目是影响肝癌患者术后无复发生存(RFS)及总生存期(OS)的独立危险因素。结论:CUEDC2在多数肝癌组织中有表达,与肿瘤的生长、分化及预后有关;CUEDC2可以作为一个有价值的肝癌预后预测的新指标。     

bcl-2基因表达在genistein抑制裸鼠肝癌生长中的作用

目的：探讨bcl-2基因表达变化在genistein治疗裸鼠移植人肝癌中的作用。方法:以裸鼠移植人肝癌为对照, 对照组腹腔注入含0.04%DMSO RPMI-1640培养基0.05 L/kg，genistein治疗组腹腔注入genistein 1 mg kg-1·d-1，3周后观察肝癌增长情况，并应用同位素试剂盒检测肝癌组织IP3 含量,RT-PCR分析癌组织bcl-2 mRNA表达，Western blotting 分析肝癌组织Bcl-2蛋白表达。结果:治疗组肝癌体积和重量均显著低于对照组［体积:（42.7±27.8)mm3 vs (52.3±26.5)mm3;重量:(42.7±27.8)mg vs (91.3±31.4)mg］，IP3含量显著低于对照组［(13.4±1.4)nmol/g protein vs （35.3±6.6）nmol/g protein］，bcl-2 mRNA表达显著低于对照组［RI（灰度与面积之积的相对强度）0.48±0.02 vs 0.56±0.15］, P<0.01，Bcl-2蛋白表达显著低于对照组［RI（灰度与面积之积的相对强度）1.69±0.52 vs 1.37±0.48］。结论:Genistein能减少IP3 生成,下调肝癌组织bcl-2基因表达,抑制裸鼠移植肝癌的生长。     

乳腺癌中PHF2的表达及其临床意义

目的探讨PHF2在乳腺癌细胞和组织中的表达及其与乳腺癌临床病理特征、预后的关系。方法采用q RT-PCR法检测乳腺癌及正常乳腺上皮细胞株(n=7)及配对的癌旁组织(n=30)中PHF2 m RNA的表达水平;应用Western blot法检测乳腺癌细胞株中PHF2蛋白的表达水平,免疫组化法检测乳腺癌组织(n=50)和癌旁组织(n=15)中PHF2蛋白的表达,分析PHF2表达与乳腺癌临床病理特征的关系及预后的关系。结果与正常人乳腺上皮细胞相比,PHF2 m RNA和蛋白在乳腺癌细胞株中表达下调(P0.01);与癌旁组织相比,PHF2 m RNA在90%(27/30)的乳腺癌组织中表达下调(P0.05);免疫组化结果显示:在70%(35/50)的乳腺癌组织中PHF2蛋白表达下调(P0.05);PHF2表达下调与乳腺癌患者的淋巴结转移、ER阴性及预后密切相关(P0.05)。结论 PHF2在乳腺癌中表达下调,可以作为乳腺癌预后判断的指标之一,有望成为乳腺癌治疗的新靶点。     

原发性肝细胞癌中NOP14的表达及其临床意义

目的探讨NOP14在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及临床意义。方法检测97例HCC石蜡包埋组织及其癌旁组织中NOP14的表达,分析NOP14表达与HCC临床病理特征的关系。利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)及Western blot法分别检测20对配对新鲜冻存HCC及癌旁组织中NOP14的表达。结果 NOP14在HCC组织中的高表达率为64. 9%(63/97),癌旁组织中的高表达率为12. 4%(12/97),差异有统计学意义(P 0. 001),NOP14在HCC组织中的高表达与肿瘤血管侵犯(P=0. 004)、TNM分期(P=0. 013)及Edmondson分级(P=0. 009)差异有统计学意义。qRT-PCR及Western blot法检测均显示HCC组织中NOP14的表达量显著高于配对癌旁组织,差异有统计学意义(P 0. 001,P 0. 001)。Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验显示:NOP14高表达与低表达患者的中位生存期分别为17、35个月,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论 NOP14的表达与HCC是否存在血管侵犯、TNM分期以及Edmondson分级均有显著相关性,检测NOP14有助于HCC患者病情评估。     

MMP-2,TIMP-1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及抑制剂-1(TIMP-1)在人肝癌及癌旁组织中的表达及其与肝癌侵袭转移的关系.方法:应用免疫组织化学法研究50例肝癌及癌旁组织中MMP-2和TIMP-1的表达.结果:MMP-2在肝癌和癌旁组织表达阳性率分别为76%和72%,明显高于正常肝组织的表达(P<0.01)a TIMP-1在肝癌组织和癌旁组织中的表达阳性率分别为58%和56%,高于正常肝组织中的表达(P<0.01).而MMP-2洋相表达率与肝细胞癌的转移、淋巴浸润、包膜形成和肿瘤分化有关(P<0.05).而TIMP-1的表达与癌组织的转移,淋巴结浸润和包膜形成有关(P<0.05).结论:MMP-2,TIMP-1在肝癌及癌旁组织中的表达明显增高,可能对于判断肝癌的浸润、转移有重要价值.     

慢病毒短发夹RNA介导的多形性腺瘤基因样蛋白2沉默对肝癌细胞MHCC97-L增殖、迁移及侵袭的影响

目的 探讨慢病毒短发夹RNA(shRNA)介导的多形性腺瘤基因样蛋白2(PLAGL2)沉默对肝癌细胞恶性行为的影响及其机制.方法 Real-time PCR与Western blotting分别检测肝癌组织及癌旁组织中PLAGL2的表达水平;体外培养肝癌细胞MHCC97-L,构建慢病毒载体质粒PLAGL2-shRNA与...     

miR-204通过下调Bcl-2和Sirt1表达抑制肝癌细胞生长

目的探讨微小RNA 204(miR-204)在肝细胞癌中的表达、临床意义及可能分子机制。方法收集手术切除的60例肝细胞癌及对应癌旁肝组织,实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-204在肝癌及癌旁组织中的表达,免疫组织化学染色检测miR-204下游潜在靶点Bcl-2与组蛋白脱乙酰酶1(Sirt1)的表达;用人工合成的miR-204模拟物转染人SMMC-7721肝癌细胞,MTT法及流式细胞术检测SMMC-7721细胞的增殖、凋亡的情况,qRT-PCR、Western blot法分别检测Bcl-2与Sirt1的mRNA和蛋白表达。结果 miR-204在肝癌组织中表达水平显著低于对应癌旁组织;肝癌组织中miR-204低表达与肿瘤大小、肿瘤个数、肿瘤TNM分期显著相关;miR-204低表达组Bcl-2与Sirt1蛋白表达显著高于miR-204高表达组,相关性分析结果显示肝癌组织中miR-204与Bcl-2、Sirt1蛋白表达呈显著负相关;miR-204可显著抑制SMMC-7721细胞的增殖并促进其凋亡,并下调Bcl-2与Sirt1的mRNA与蛋白表达水平。结论 miR-204在肝癌组织中表达下调并与肝癌恶性临床病理特征有关,miR-204抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡的作用可能与下调Bcl-2和Sirt1表达有关。     

抗人肝癌单克隆抗体HL2的制备及鉴定

用肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721以贯序法免疫BALB/c小鼠,获得一株分泌肝癌单抗的杂交窟株HL_2,其染色体数目为97—105。单抗HL_2系IgG_2b亚类。吸收实验及阻断实验证明HL_2抗原与CEA、AFP、HBsAg、HBcAg及HBeAg无免疫同源性。ABC法和ELISA法说明单抗HL_2与四株肝癌细胞、六例肝癌组织均呈明确阳性反应,除与SGC-7901、H_(128)、K_(562)、Hela细胞株及部分胚胎肝脏,胚胎结肠有较弱性反应外,与肝癌旁组织、正常肝脏、其它肿瘤组织和细胞株、二种正常人细胞及其它胚胎组织无反应。显示了单抗HL_2的特异性较好、阳性率较高,是一个有应用前景的单抗。     

MDM2和P53蛋白表达与原发性肝细胞肝癌发生的关系

目的:研究MDM2和突变型P53蛋白表达与原发性肝细胞肝癌(HCC)发生的关系。方法: 用免疫组织化学SP法,检测55例HCC癌组织、23例癌旁组织、10例正常肝组织MDM2和突变型P53蛋白表达情况。结果: 55例HCC中MDM2蛋白阳性表达17例(30.9%),突变型P53蛋白阳性表达23例(41.8%),二者均阳性表达11例(20%),MDM2和突变型P53蛋白表达有相关性(r=0.310, P＜0.05)。23例癌旁组织MDM2蛋白阳性1例,突变型P53蛋白阳性表达2例,肝癌组织和癌旁组织MDM2和突变型P53蛋白表达有差异(P＜0.05)。10例正常肝组织无MDM2和突变型P53蛋白表达。结论: 肝细胞癌组织有MDM2和突变型P53过量表达,MDM2蛋白和/或 p53 基因突变使 p53 基因功能失活在HCC发生中可能有重要作用。     

Sestrin 2(SESN2)通过激活蛋白激酶B促进肝癌细胞索拉非尼原发性抵抗

目的探讨sestrin 2(SESN2)在肝癌细胞索拉非尼原发性抵抗中的作用和机制。方法实时定量PCR和Western blot法检测Bel-7404、SNU-398、HLE、HLF、Hep3B肝癌细胞系中SESN2 mRNA和蛋白水平,免疫组织化学染色检测肝癌组织中SESN2的表达。分别用(0、2、5、10、15、20、25)μmol/L索拉非尼处理上述肝癌细胞24 h,采用CCK-8法检测肝癌细胞增殖活性并计算索拉非尼半数抑制浓度(IC50),(0、2、4、6、8)μmol/L索拉非尼刺激Bel-7404、SNU-398肝癌细胞24 h,检测癌细胞SESN2 mRNA和蛋白水平;采用SESN2的特异性小干涉RNA(si SESN2)敲低Bel-7404、SNU-398肝癌细胞的SESN2水平,再分别用(0、8)μmol/L索拉非尼刺激24 h,CCK-8法检测细胞增殖活性、流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)水平。结果与正常肝细胞和癌旁肝组织相比,肝癌细胞系和肝癌组织中SESN2水平升高,且癌细胞中SESN2水平与索拉非尼IC50呈正相关;索拉非尼刺激Bel-7404、SNU-398肝癌细胞后,癌细胞SESN2水平升高,AKT信号活化;敲低Bel-7404、SNU-398肝癌细胞的SESN2水平,可进一步抑制细胞增殖活性、促进细胞凋亡、抑制AKT磷酸化。结论 SESN2可通过激活AKT信号促进肝癌细胞索拉非尼原发性抵抗。     

RT-PCR检测肝炎和肝癌组织中的HCV复制中间体

应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测11例血清抗HCV阳性的药瘾患者尸检肝组织和10例原发性肝细胞癌(PHC)患者手术切除肝癌组织中HCV基因(正链HCV RNA)和HCV复制中间体(负链HCV RNA)。结果8/11例肝组织和7/10例肝癌组织中正链HCV RNA阳性,其中各有6例负链HCV RNA亦阳性。HCV各基因区的检出率差别较大,5′NC区检出率最高、C区次之、NS区检出率较低。在同例肝(癌)组织中,若负链HCV RNA阳性,则其信号强度与正链基因无明显差别;但未发现肝癌组织中癌细胞分化程度与HCV的检出率有关。上述结果提示HCV感染与肝癌发生有密切关系,HCV的持续复制可能在癌肿形成中起作用。     

Gab2在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及意义

目的:探讨Grb2协同结合蛋白2(Gab2)在人骨肉瘤细胞系中的表达及其与人骨肉瘤细胞侵袭转移的关系。方法:应用小RNA干扰技术,将合成的小RNA干扰质粒转染给人骨肉瘤U2-OS细胞,采用Western blotting和RT-PCR法检测转染后Gab2的蛋白和mRNA表达水平;体外细胞趋化运动实验和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果:Gab2在人骨肉瘤U2-OS细胞系中高表达,且转染Gab2 siRNA后的细胞(Si Gab2/U2-OS)中Gab2蛋白及mRNA的表达水平低于转染scramble siRNA细胞(Scr/U2-OS)和U2-OS;趋化运动实验发现在10μg/L表皮生长因子(EGF)的诱导下Si Gab2/U2-OS细胞的迁移能力较U2-OS和Scr/U2-OS细胞明显下降,差异有统计学意义(P0.01);Si Gab2/U2-OS细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量均比Scr/U2-OS细胞和U2-OS细胞少,Si Gab2/U2-OS细胞的体外侵袭能力显著降低(P0.01)。结论:利用siRNA干扰技术降低Gab2的表达对人骨肉瘤U2-OS细胞的迁移和侵袭能力有明显的抑制作用。     

Plk1、Chk1/2在原发性肝癌组织及HepG2细胞中的表达研究

目的:研究保罗样激酶1(Polo-like kinase1,Plk1)、细胞周期检测点激酶1、2(Checkpoint kinase 1/2,Chk1/2)在原发性肝癌组织与人肝癌细胞Hep G2中的表达情况。方法:使用免疫组织化学Envision法检测40例原发性肝癌组织及16例肝非肿瘤组织中Plk1、Chk1/2蛋白的表达。提取培养后的Hep G2细胞蛋白。利用蛋白免疫印记(Western blot)技术定性分析Plk1、Chk1/2蛋白在Hep G2细胞中的表达情况,并测定灰度值进行定量分析。结果:原发性肝癌组织中Plk1、Chk1蛋白的阳性表达率分别是57.5%、75%,高于它们在肝非瘤组织中的表达率0%、25.0%(P0.05)。Chk2在原发性肝癌组织中的表达阳性率22.5%,低于肝非肿瘤组织中的表达率56.3%(P0.05)。Plk1、Chk1/2蛋白在Hep G2细胞中均有表达。其相对表达量分别是:0.39±0.022 6、0.08±0.024 9、0.01±0.006 6,三者之间的差异均有统计学意义,其表达的顺序依次为Plk1Chk1Chk2。结论:Plk1、Chk1蛋白在原发性肝癌组织中表达上调,而Chk2蛋白在原发性肝癌组织中表达下调。Plk1、Chk1/2基因作为细胞周期调控中的重要激酶在Hep G2细胞中均有表达,其表达顺序为Plk1Chk1Chk2。Plk1、Chk1具有相对意义的肿瘤选择性表达,可能成为肝癌生物治疗中新的治疗靶点。     

M2型肿瘤相关巨噬细胞通过p53途径下调肝癌化疗敏感性的机制研究

目的 通过研究M2肿瘤相关巨噬细胞调控p53表达来下调肝癌化疗敏感性的机制,以此拓宽建立抗肿瘤耐药的措施.方法 构建小鼠肝癌模型及分离肝癌组织,研磨组织提取巨噬细胞,通过RT-PCR方法检测巨噬细胞表面CD206及CD163分子表达情况.培养人单核巨噬细胞(THP-1),PMA (100ng/mL)和IL-4 (100ng/mL)作用诱导分化成肿瘤相关巨噬细胞后,与肝癌细胞(HepG2、SMMC7721,Hep 3B)共培养,加入奥沙利铂(20μ g/mL)作用24小时,通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、抗凋亡蛋白Bcl-2及p53的表达,通过MTT方法检测化疗对肝癌细胞增殖情况.结果 成功构建了肝癌模型,分离出了肝癌组织巨噬细胞,RT-PCR检测CD206和CD163的表达显著升高;人单核细胞(THP-1)经加入PMA(100ng/mL)和IL-4 (100ng/mL)分化诱导48h后其细胞的表面CD206和CD163的表达明显高于THP1分化诱导的细胞表面表达量;肝癌细胞SMMC7721和HepG2与M2型肿瘤相关巨噬细胞共培养24h,经奥沙利铂作用后,肿瘤细胞Bcl-2表达明显升高,Caspase 3和p53的表达显著降低;肿瘤细胞的增殖抑制率明显降低,而Hep 3B细胞的凋亡则明显降低.结论 M2型肿瘤相关巨噬细胞调控肝癌细胞中p53的表达,进而抑制了肝癌化疗的敏感性.     

Wnt2在肝细胞肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响

 目的 探讨Wnt2在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及转染靶向Wnt2的siRNA对人肝癌HepG2细胞的抑制效果。方法 实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测Wnt2在肝癌组织,癌旁组织及正常肝组织的表达差异;使用siRNA沉默人肝癌HepG2细胞Wnt2的表达后,检测Wnt2基因和蛋白的表达变化,并检测细胞的增殖和周期变化。结果 1）在上述组织中,Wnt2在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低。2）使用siRNA沉默人肝癌HePG2细胞Wnt2后,Wnt2基因和蛋白表达下调,细胞增殖受抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期细胞所占比例下降。结论 肝细胞肝癌中存在Wnt2的高表达;siRNA可抑制HepG2细胞Wnt2的表达,并抑制HepG2生长,Wnt2基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。     

Rock2对细胞周期检查点Cdc25A的调节作用

目的: 探讨肝癌细胞中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2(Rock2)对细胞周期检查点细胞分裂周期蛋白25A(Cdc25A)的调节作用。方法: Western blotting 检测51对肝癌及癌旁组织中Rock2与Cdc25A的蛋白表达情况。构建并筛选shRock2干扰质粒,稳定转染到人肝细胞癌Huh-7和HepG2细胞中,Western blotting检测Cdc25A蛋白表达变化;针对Rock2干扰序列,利用PCR定点突变技术进行碱基突变,构建Rock2突变质粒从而"恢复"Rock2表达,分析Cdc25A蛋白表达变化并用MTT法检测肝癌细胞增殖的改变。Western blotting检测Rock2稳定低表达的肝癌细胞中检查点激酶1(Chk1)和检查点激酶2(Chk2)蛋白的变化,免疫共沉淀及免疫荧光分析Rock2与Cdc25A的相互作用。结果: Rock2与Cdc25A蛋白在肝癌组织中较癌旁组织呈现高表达,而且两者呈正相关。肝癌细胞中稳定低表达Rock2后,Cdc25A蛋白表达明显下降;"恢复"Rock2表达后,Cdc25A蛋白表达增加而且肝癌细胞也出现增殖加快现象。Rock2低表达对Chk1和Chk2蛋白变化无明显影响。免疫共沉淀表明Rock2与Cdc25A直接相互作用,免疫荧光检测表明Rock2与Cdc25A存在共定位。结论: Rock2对细胞周期检查点Cdc25A起直接的正向调控作用,而且不依赖于Chk1/Chk2,可能为肝癌基因表达调控研究提供新的靶基因。     

PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖及Ca2+水平的影响

目的： 研究PAR-2激动剂对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞内Ca2+浓度（［Ca2+］c）的影响。方法: 培养人肝癌细胞HepG2, 分别利用PAR-2激动剂SLIGKV-NH2及反PAR-2激动肽VKGILS-NH2干预肝癌细胞生长,用Fura-2荧光法测定肝癌细胞内［Ca2+］c,用MTT法检测对肝癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术（FCM）检测细胞周期改变情况,RT-PCR法检测cyclinD1 mRNA表达变化。结果: 50 μmol/L SLIGKV-NH2刺激HepG2细胞后,［Ca2+］c迅速短暂升高（P<0.01）;G0/G1期比例明显降低,S期和G2/M期细胞比例和细胞增殖指数(PI)明显提高（P<0.01）;cyclinD1 mRNA的表达显著增加（P<0.01）。SLIGKV-NH2在1-50 μmol/L时可以促进HepG2细胞增殖,呈剂量依赖性（P<0.01或P<0.05）。而VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著（P>0.05）。结论: PAR-2激动剂在体外能通过激活PAR-2,诱导HepG2细胞内［Ca2+］c升高,上调cyclinD1 mRNA的表达,加速HepG2细胞周期进程,促进DNA合成,促进肝癌细胞增殖。