柯萨奇病毒B3(CVB3)通过激活NADK2促进小鼠巨噬细胞NLRP3的活化

目的 研究在柯萨奇病毒B3(CVB3)刺激下，小鼠巨噬细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)表达的变化及机制。方法 CVB3刺激RAW264.7细胞、小鼠原代(骨髓来源或腹腔)巨噬细胞以及感染NLRP3短发夹RNA(shRNA-NLRP3)慢病毒的RAW264.7细胞，实时荧光定量PCR检测NLRP3和白细胞介素1β(IL-1β)表达水平；ELISA检测细胞上清中IL-1β的含量；Western blot法检测NLRP3蛋白的变化，免疫共沉淀(Co-IP)法检测NLRP3相互作用蛋白的表达。结果CVB3刺激RAW264.7细胞、骨髓来源或腹腔巨噬细胞后，NLRP3和IL-1β表达明显升高；下调NLRP3后，IL-1β分泌明显减少；NLRP3抗体Co-IP所得复合物银染，组间差异蛋白经质谱分析鉴定为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶2(NADK2),证明CVB3诱导NADK2与NLRP3相互作用。结论 CVB3通过激活NADK2促进巨噬细胞NLRP3活化，增加炎症因子IL-1β表达和释放。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制脂多糖诱导巨噬细胞趋化因子的表达

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞趋化因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)表达的影响。方法小鼠RAW264.7巨噬细胞用1 mg/L LPS进行刺激,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测MCP-1与MIP-2 mRNA水平、ELISA检测培养液中MCP-1与MIP-2的蛋白含量。结果 1 mg/L LPS可显著刺激RAW264.7细胞MCP-1和MIP-2 mRNA表达,单独EGCG对MCP-1和MIP-2基因表达无明显影响,但EGCG可以抑制LPS诱导的MCP-1和MIP-2的表达,并存在剂量依赖效应。结论 EGCG能以剂量依赖方式抑制LPS诱导的巨噬细胞MCP-1和MIP-2的表达。     

胞红蛋白对巨噬细胞氧化损伤的保护作用

<正>目的:本文探讨巨噬细胞氧化应激过程中胞红蛋白(CYGB)表达模式;研究CYGB在巨噬细胞氧化应激过程中的作用。方法:(1)Western blot检测RAW264.7细胞在H2O2刺激不同时间CYGB的蛋白表达水平;检测RAW264.7细胞在不同浓度H2O2刺激12 h时CYGB蛋白的表达水平。(2)构建CYGB过表达/低表达巨噬细胞模型,将RAW264.7细胞分为4组:对照     

Rab18通过JAK2/STAT3下调PLIN2并减少THP-1巨噬细胞脂质蓄积

目的：研究Rab18是否通过Janus激酶2(JAK2)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路下调脂滴包被蛋白2(PLIN2)表达,并影响人THP-1巨噬细胞脂质蓄积。方法：采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育人THP-1巨噬细胞不同时间（0、6、12和24 h）,用Western blot检测细胞内Rab18、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3及PLIN2蛋白水平,使用油红O染色法观察细胞内脂质蓄积的变化。制备野生型、活化型和失活型Rab18巨噬细胞,予以ox-LDL孵育,Western blot和RT-qPCR检测细胞内Rab18、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3及PLIN2蛋白水平,细胞免疫荧光技术观察巨噬细胞内p-JAK2和p-STAT3的核转位情况。用JAK2抑制剂AG490预处理活化型Rab18细胞,再用ox-LDL孵育该细胞,Western blot和RT-qPCR检测JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3及PLIN2蛋白水平,细胞免疫荧光技术观察巨噬细胞中PLIN2的表达,油红O染色和GPO-PAP酶法观察细胞...     

TIPE2通过抑制Akt磷酸化促进LPS活化的巨噬细胞凋亡

目的:探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)对脂多糖(LPS)活化的巨噬细胞凋亡的影响及作用机制.方法:采用LPS(1.0 mg/L)处理RAW264.7细胞24 h,RT-qPCR检测IL-6、TNF-α、TIPE2 mRNA表达,Western blot检测TIPE2蛋白表达.采用LPS处理稳定过表达或...     

LRRK2/NF-κB信号对BCG诱导巨噬细胞RAW264.7炎症应答的调控

目的:探讨富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用机制。方法:用结核分枝杆菌疫苗株卡介苗(BCG)感染巨噬细胞RAW264.7,菌落形成单位(CFU)计数检测结核分枝杆菌生存率;酶联免疫吸附法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ)表达水平;q PCR和Western blot法分别检测相关m RNA和蛋白的表达。结果:BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中LRRK2的m RNA和蛋白表达均显著上调,并刺激RAW264.7细胞释放大量细胞因子。此外,沉默LRRK2明显抑制BCG感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率;同时,沉默LRRK2降低BCG刺激诱导分泌的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ。更为重要的是,LRRK2可能通过正调控NF-κB通路调节BCG诱导的炎症应答进程。结论:LRRK2/NF-κB信号正调控BCG刺激诱导的巨噬细胞炎症应答进程。本研究结果为结核病在基因水平上的诊断和治疗提供了实验依据。     

消耗还原型谷胱甘肽抑制血管紧张素Ⅱ激活巨噬细胞c-Jun/ATF-2及NF-κB

目的:探讨还原型谷胱甘肽(GSH)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)激活巨噬细胞转录因子c-Jun/ATF-2及NF-κB中的作用。方法:用荧光分光光度法测定细胞内GSH含量;用丁基硫堇硫氧胺(BSO)消耗细胞内GSH;用免疫印迹法测定细胞c-Jun/ATF-2磷酸化表达及NF-κBp65表达;用凝胶滞留法测定细胞NF-κB活性;用细胞免疫组化观察细胞c-Jun/ATF-2磷酸化表达的时间模式。结果:AngⅡ(1μmol/L)刺激30-60min可降低RAW264.7细胞内GSH;而后GSH逐渐适应性恢复。同时,AngⅡ刺激60min,呈剂量依赖性降低RAW264.7细胞内GSH。GSH特异性消耗剂BSO(0.5mmol/L)与RAW264.7细胞共同孵育18h,即可完全消耗细胞内GSH。AngⅡ(1μmol/L)可诱导RAW264.7巨噬细胞c-Jun/ATF-2磷酸化表达;BSO预先完全消耗细胞内GSH,AngⅡ(1μmol/L)不能诱导巨噬细胞c-Jun/ATF-2磷酸化。同样,AngⅡ(1μmol/L)可激活RAW264.7巨噬细胞NF-κB;BSO预先完全消耗细胞内GSH,AngⅡ(1μmol/L)不能激活巨噬细胞NF-κB。结论:还原型谷胱甘肽可能参与调控巨噬细胞转录因子c-Jun/ATF-2及NF-κB的转录活性。     

免疫抑制剂对巨噬细胞Dectin-1 和TLR2 表达的影响

目的:研究地塞米松、环磷酰胺、环孢素A 和霉酚酸酯对小鼠RAW264.7 巨噬细胞Dectin-1 和TLR2 受体表达的影响。方法:体外培养RAW264.7 巨噬细胞,分别给予不同浓度的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A 和霉酚酸酯刺激细胞24 h,CCK-8 检测RAW264.7 细胞毒性作用,RT-PCR 检测细胞Dectin-1 和TLR2 mRNA 表达情况,流式细胞术检测Dectin-1 和TLR2 蛋白水平变化。结果:不同剂量的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A 和霉酚酸酯作用细胞24 h 后均对细胞表现出一定的毒性作用(P<0.05),且随着药物浓度增加毒性作用越大。地塞米松降低Dectin-1 mRNA 和蛋白水平的表达,上调TLR2 受体转录和翻译(P<0.05);环磷酰胺对巨噬细胞Dectin-1 和TLR2 的转录翻译无明显影响(P>0.05);霉酚酸酯和环孢素A 能够同时下调Dectin-1、TLR2 mRNA 和蛋白水平表达(P<0.05)。结论:不同免疫抑制剂对模式识别受体表达的调节作用具有差异性,通过选择性调节各自靶点PRRs 的表达抑制机体对各种真菌病原体的免疫识别过程,同时也能够抑制巨噬细胞的生长增殖,共同介导免疫抑制功能。     

Sesn2通过激活mTOR信号通路调节LPS诱导的巨噬细胞M1极化和炎症反应

目的：探讨sestrin 2 (Sesn2)在巨噬细胞中的功能及其通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路对巨噬细胞极化和炎症的影响。方法：用小干扰RNA构建Sesn2沉默（si-Sesn2）的RAW264.7小鼠巨噬细胞胞株,通过脂多糖（LPS）处理RAW264.7细胞建立体外炎症模型。RT-qPCR评估白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、CD86和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA水平;ELISA检测培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;流式细胞术确定CD86标记的M1型巨噬细胞百分比;Western blot分析mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）和真核翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)的蛋白表达水平。结果：在LPS诱导的体外炎症模型中,Sesn2在RAW264.7细胞中的表达上调,IL-1β、IL-6、TNF-α以及M1型巨噬细胞标志物CD86和iNOS的表达显著增加,伴随mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达水平的升高。而si-Sesn2进一步促进了上述效应,但这些变化可通过雷帕霉素预处理减轻。结论：S...     

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP-C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7, 以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照.采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位.结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内.结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达.Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白.     

miR-146a对小鼠巨噬细胞IL-18表达的影响

目的:探讨miR-146a对小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7以及小鼠原代腹腔巨噬细胞Thl/Th2类细胞因子表达的影响。方法:体外培养的小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞和腹腔新鲜分离的巨噬细胞分别瞬时转染miR-146a mimics、阴性对照mimics(NC mimics)、抑制性miR-146a(miR-146a inhibitor)和抑制性miR-146a阴性对照(NC in-hibitor)。转染后,利用real time PCR定量检测IL-18、IL-5和IL-10的表达情况。结果:RAW264.7细胞和原代腹腔巨噬细胞在转染miR-146a mimics后IL-18的表达水平明显降低(P<0.05),转染miR-146a inhibitor后IL-18的表达水平明显升高(P<0.05),但对IL-5和IL-10的表达,两种转染形式均没有影响。结论:巨噬细胞RAW264.7及原代巨噬细胞表达的miR-146a能够负向调控Thl类细胞因子IL-18的表达,但是不能调控Th2类细胞因子IL-5及IL-10的表达。     

川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制

目的：研究川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制。方法：MTT法检测川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7细胞活力的影响。ELISA检测脂多糖（LPS）诱导状态下RAW264.7细胞上清中TNF-α和IL-6的分泌量；Griess法检测LPS诱导状态下RAW264.7细胞上清中一氧化氮（NO）含量；荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6、精氨酸酶-1(Arg-1)、血红素加氧酶1(HO-1)和细胞因子信号转导抑制蛋白-2(SOCS2)基因表达水平。Western blot检测一氧化氮合酶（iNOS）和p-p65蛋白表达。结果：在LPS诱导的RAW264.7细胞中，川续断皂苷Ⅵ抑制TNF-α、IL-6、iNOS和p-p65蛋白或基因表达水平，同时增加HO-1基因表达。川续断皂苷Ⅵ能抑制LPS诱导下RAW264.7细胞分泌的NO。川续断皂苷Ⅵ增加IL-4诱导下M2型巨噬细胞标志物Arg1和SOCS2基因表达。结论：川续断皂苷Ⅵ可以抑制RAW264.7巨噬细胞向M1型极化，同时促进其向M2型极化，可通过调节M1/M2型巨噬细胞极化发挥其抗炎免疫调节作用。     

连翘酯苷A通过抑制PI3K/Akt通路并激活Nrf2/HO-1通路抑制LPS诱导的炎症及氧化应激

目的 探讨连翘酯苷A(forsythiaside A,FSA)对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症和氧化应激的影响.方法 建立LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞模型,给予不同质量浓度连翘酯苷A,以观察其对炎症介质(NO和PGE2)生成和促炎细胞因子(TNF-α和IL-1β)表达的影响,并探讨其可能机制.结果 ...     

青藤碱对LPS、IL-4诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的影响

目的:探讨青藤碱(Sinomenine,SIN)对脂多糖(LPS)以及白细胞介素4(IL-4)诱导的RAW264.7细胞向M1、M2型极化的影响。方法:以LPS刺激RAW264.7细胞诱导M1型极化,IL-4刺激RAW264.7细胞诱导M2型极化;青藤碱作用于LPS或IL-4诱导的巨噬细胞后:用酶联免疫法(ELISA)检测不同诱导状态下RAW264.7细胞TNF-α和IL-10的分泌量;荧光定量PCR检测与巨噬细胞极化相关的精氨酸酶-1(Arg-1)、一氧化氮合酶(i NOS)、细胞因子信号转导抑制蛋白-2(SOCS2)和细胞因子信号转导抑制蛋白-3(SOCS3)的mRNA表达水平。结果:青藤碱能抑制LPS诱导下细胞TNF-α的分泌量,抑制细胞i NOS和SOCS3的mRNA表达水平的升高。青藤碱能抑制IL-4诱导下细胞IL-10的分泌量和Arg1的mRNA表达水平的升高,对IL-4诱导下细胞SOCS2的mRNA表达水平的升高没有明显影响。结论:青藤碱对LPS诱导下巨噬细胞向M1型极化具有抑制作用;对IL-4诱导下巨噬细胞向M2型极化具有抑制作用。青藤碱对M1/M2亚型的失衡具有调节作用,有利于维持其动态平衡。     

ARIP2在小鼠巨噬细胞系RAW264.7中对IL-1β分泌的抑制作用

研究ARIP2在巨噬细胞中对IL-1β分泌的调节作用,探讨激活素A与巨噬细胞活化的可能关系及其作用机制。为了分析ARIP2在小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中的表达及其生物学作用,实验采用RT-PCR方法检测RAW264.7细胞中ARIP2 mRNA的表达,ELISA方法观察过表达ARIP2对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响。RAW264.7细胞能够表达特异性ARIP2 mRNA,其RNA表达受激活素A刺激呈剂量依赖性增加。ELISA检测结果显示过表达ARIP2可以抑制RAW264.7细胞分泌IL-1β。上述资料提示ARIP2不仅具有抑制激活素诱导的特异基因转录活性,其自身也具有多种生物学活性,可能在激活素A抑制LPS活化巨噬细胞分泌IL-1方面,发挥关键性信号转导调控作用。     

小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响

 目的：建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6（CFP10-ESAT6）真核表达质粒并转染RAW2647巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法：将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱（staurosporine）处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2（TLR2）的表达。结果：成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P＜0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P＜0.05)。结论：巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。     

槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14、P38、iNOS表达的影响

目的 探讨槐定碱不同给药方式对内毒素诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞表达CD14、p38 MAPK及i NOS的影响及意义。方法 采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型;实验细胞分为4组(n=6):空白对照组、LPS组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组;分别利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p38、i NOS m RNA表达量及蛋白表达量。结果 槐定碱2种给药方式(预处理及预混合)均可显著下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p38、i NOS m RNA及CD14、p-p38、i NOS蛋白表达;槐定碱与LPS预混合可下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14 m RNA表达,而槐定碱预处理对CD14 m RNA表达无明显影响。结论 槐定碱可能通过调控CD14、p38、i NOS表达与活化发挥抗内毒素效应。     

链球菌蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫学活性的调节作用

目的:探讨链球菌蛋白对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫活性调节及其相关作用机制.方法:不同浓度的链球菌蛋白与RAW264.7小鼠巨噬细胞共同作用后,采用MTT 法检测细胞的增殖活化;吞噬中性红试验观察巨噬细胞的吞噬功能;生物化学法检测巨噬细胞上清液中TNF-α和IL-6 的含量;RT-PCR法检测细胞中TNF-α、IL-6和Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)的mRNA表达情况;流式细胞术检测细胞表面TLR2和TLR4的表达强度.结果:链球菌蛋白对巨噬细胞的生长增殖和吞噬功能有较强的刺激作用(P<0.05),促进TNF-α和IL-6的表达和分泌(P<0.05),并可上调巨噬细胞表面模式识别受体TLR2和TLR4的表达(P<0.05).结论:链球菌蛋白通过刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖,增强细胞吞噬活性以及诱导细胞因子的产生等发挥其免疫调节作用.     

血管紧张素Ⅱ活化JAK2/STAT3信号上调CXCL4的表达促进RAW264.7巨噬细胞衰老

目的 探究血管紧张素Ⅱ在巨噬细胞(macrophage, M_φ)衰老过程中的作用及其潜在的机制。方法 Western blot分别检测血管紧张素Ⅱ处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21表达，信号分子JAK2、STAT3表达，磷酸化分子p-JAK2、p-STAT3蛋白表达以及CXCL4的表达；CXCL4处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21的表达；JAK2/STAT3磷酸化抑制剂预处理后CXCL4蛋白表达。qRT-PCR与Western blot检测siCXCL4处理RAW264.7后p16、p21以及CXCL4的表达；β-半乳糖苷酶染色检测RAW264.7衰老。结果 血管紧张素Ⅱ处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21以及CXCL4表达明显增加；血管紧张素Ⅱ上调M_φ中p-JAK2、p-STAT3磷酸化水平。JAK2/STAT3磷酸化抑制剂处理后RAW264.7中CXCL4表达下调；CXCL4处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21表达增加；RAW264.7细胞系中敲除CXCL4后衰老蛋白p16、p21表达减...     

人脐血血清对巨噬细胞Toll样受体4表达及功能的影响

目的研究人脐血血清(cord blood serum,CBS)对巨噬细胞RAW264.7 Toll样受体4(Toll like receptor4,TLR4)表达及功能的影响。方法取足月孕妇脐带血和外周血血清,与RAW264.7细胞共孵育,电镜下观察形态学变化,MTT法检测血清对RAW264.7细胞活性的影响;RT-PCR和流式细胞术检测RAW264.7细胞TLR4基因和蛋白表达水平;免疫荧光技术检测RAW264.7细胞I_κB_α水平,RR-PCR检测RAW264.7细胞COX-2的表达,以反映TLR4信号途径活化程度。结果人脐血血清可下调RAW264.7细胞TLR4的mRNA和蛋白表达水平;人脐血血清预孵育可抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞NF-_κB激活和COX-2的表达。结论人脐血血清能抑制巨噬细胞TLR4的表达及其下游信号传递,这为阐明脐血血清对脐血细胞免疫功能调节的机制提供了新的实验线索。