无镁诱导培养的大鼠皮层神经元癫疒间样放电

目的: 观察无镁细胞外液短暂处理培养的胚胎鼠大脑皮层神经元能否诱导自发、反复的惊厥样放电.以期提供一种较好的研究发育中脑癫活动的细胞模型.方法:采用全细胞电流钳记录技术,记录体外培养12～18 d的大脑皮层神经元在正常细胞外液、无镁细胞外液、无镁细胞外液处理3 h继而恢复正常细胞外液后1～2 h、24 h、72 h神经元电活动的变化.结果:(1)神经元在正常细胞外液中自发放电形式表现为兴奋性突触后电位(EPSP)及约16次/min左右的动作电位(n=29).(2)无镁细胞外液孵育3 h,孵育期间100%的细胞(n=25)放电形式发生改变,表现为两种形式:持续强直的高频爆发及"楔形"去极化.(3) 经无镁细胞外液孵育3 h恢复正常细胞外液后2 h 100%的细胞发生异常放电(n=12),72 h仍有近80%的细胞发生异常放电,主要表现为阵发性持续棘波样爆发、"楔形"去极化及PDSs样发作(paroxysmal depolarizing shifts).结论: 培养的胚胎鼠皮层神经元予短暂的无镁处理后可诱导自发、反复的惊厥样活动,且惊厥样活动可持续72 h,为进一步研究发育中惊厥性脑损伤及保护提供了较好的癫细胞模型.     

无镁诱导培养的大鼠皮层神经元癫痫样放电

目的：观察无镁细胞外液短暂处理培养的胚胎鼠大脑皮层神经元能否诱导自发、反复的惊厥样放电。以期提供一种较好的研究发育中脑癫痫活动的细胞模型。方法：采用全细胞电流钳记录技术，记录体外培养12－18d的大脑皮层神经元在正常细胞外液、无镁细胞外液、无镁细胞外液处理3h继而恢复正常细胞外液后1－2h、24h、72h神经元电活动的变化。结果：（1）神经元在正常细胞外液中自发放电形式表现为兴奋性突触后电位（EPSP）及约16次／min左右的动作电位（n=29)。（2）无镁细胞外液孵育3h，孵育期间100％的细胞（n=25)放电形式发生改变，表现为两种形式：持续强直的高频爆发及“楔形”去极化。（3）经无镁细胞外液孵育3h恢复正常细胞外液后2h 100%的细胞发生异常放电（n=12),72h仍有近80％的细胞发生异常放电，主要表现为阵发性持续棘波样爆发、“楔形”去极化及PDSs样发作（paroxysmal depolarizing shifts)。结论：培养的胚胎鼠皮层神经元予短暂的无镁处理后可诱导自发、反复的惊厥样活动，且惊厥样活动可持续72h，为进一步研究发育中惊厥性脑损伤及保护提供了较好的癫痫细胞模型。     

白细胞介素1受体拮抗剂对无镁诱导培养的大鼠发育中神经元惊厥性损伤的保护作用

目的:探讨IL-lra对体外发育不同阶段神经元惊厥性损伤的拮抗作用及可能机制.方法:以培养的发育中皮层神经元为研究对象,MTT代谢率观察神经元损伤,激光共聚焦显微镜扫描检测神经元[Ca2 ]i,real-time定量RT-PCR方法测定NMDAR mRNA表达.结果:(1)IL-1ra预处理后再给无镁 IL-1ra处理,与同期单纯无镁组比较,6 d的神经元MI T代谢率无明显改变,而17 d的神经元显著增高.(2)IL-1ra预处理后,6 d、17 d的神经元[Ca2 ]i峰值显著低于同期单纯无镁组,但拮抗[Ca2 ]i增高的作用在6d的神经元较17d的神经元更明显.(3)IL-lra预处理后,6 d、17 d的神经元NR1 mRNA表达有所降低,且IL-1ra降低不同培养时间NR1 mRNA的作用差异无显著性;用IL-1ra后17d神经元的NR2A mRNA表达降低,与同期对照组比较差异无显著性,而6 d神经元NR2A mRNA表达仍高于同期对照组;IL-1ra对不同培养时间NR2B mRNA均无明显降低作用.结论:IL-1ra对神经元惊厥性损伤的保护作用有一定的年龄依赖性.这种保护作用可能通过减轻细胞内Ca2 超载及其它机制实现.     

早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元细胞内游离钙的远期影响

目的探讨早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元功能及NMDA激发后细胞内[Ca2 ]i的远期影响。方法以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型。根据对培养6d皮层神经元的不同处理分为三组正常DMEM培养液组(CONT1)、正常细胞外液组(CONT2)和无镁细胞外液组(MGF)。神经元分别在上述三种液体中孵育3h,然后恢复正常DMEM培养基继续培养,在培养7,12及17d时测定皮层神经元噻唑蓝(MTT)代谢率及荧光数码扫描显微镜测定[Ca2 ]i信号的变化,100μmol/LNMDA刺激神经元。[Ca2 ]i反应通过静息钙、峰值和上升时间表示。结果与CONT2和CONT1组相比,MGF组MTT代谢率在培养7和12d皮层神经元均明显降低(P<0.05);不同培养时间各组静息钙和峰值钙水平均升高(P<0.05);上升时间在培养7和17d较短(P<0.05),而12d较长(P<0.05)。CONT2组与CONT1组相比无统计学差异(P>0.05)。结论发育中皮层神经元早期无镁诱导惊厥样放电对细胞内钙具有远期影响,提供了神经元早期惊厥样放电引起远期功能损伤的可能机制。     

发育中大鼠皮层神经元惊厥样放电中PSD-95 mRNA表达改变

目的探讨早期无镁细胞外液处理后惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元PSD-95 mRNA表达的影响。方法以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型,根据对培养6d皮层神经元的不同处理分为三组：正常Neurobasal/B27培养液组（CONT组）、正常细胞外液组（PS组）和无镁细胞外液组（MGF组）。神经元分别在上述三种液体中孵育3h,然后换为正常Neurobasal/B27培养液继续培养,在处理后6,24,72h及处理后第6天时应用实时定量PCR测定PSD-95 mRNA的表达。结果与CONT组和PS组相比,MGF组PSD-95 mRNA表达在处理后24h明显增高（P〈0.05）。处理后6h,72h及第6天的皮层神经元PSD-95 mRNA表达三组中两两比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论发育中大鼠皮层神经元惊厥样放电可以导致神经元PSD-95 mRNA表达的改变。     

一种体外培养大鼠皮层神经元创伤后继发性损伤模型的建立

目的　建立一种简便的体外培养大鼠神经元创伤性损伤模型。方法采用机械划痕创伤性损伤培养大鼠皮层神经 元,根据培养细胞锥虫篮活力计数和培养上清乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）检测评估损伤程度,用中性红复染确定未损伤细胞。结 果创伤性损伤培养神经元后,锥虫篮细胞活力计数和培养上清ＬＤＨ检测对损伤程度的判定具有显著的相关性,远离 创道未直接损伤区域的神经元可产生继发性损伤。结论本模型可用于体外研究神经元创伤后原发性和继发性损伤。     

一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定

目的：对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进, 以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。方法: 使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理, 分离16~17 d胎龄的Wistar大鼠胎鼠皮层, 采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液, 经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。细胞接种当日4~6 h将含有血清的接种培养液换为添加B27的Neurobasal无血清培养基, 培养第3天(DIV3)用终浓度10 μmol/L的阿糖胞苷(cytosine arabinoside, Ara-C)处理24 h抑制胶质细胞增殖, 以后每周半量换液1次。用倒置相差显微镜观察细胞形态, 利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2, MAP2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度, 并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。 结果: 与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿, 胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比, 方法改进以后收获的细胞产量明显增加, 且消化过程对细胞损伤小, 接种后细胞分散均匀, 杂质少, 纯度高, 树突、突触发育正常, 可长期存活。 结论: 该方法简便可行, 结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。     

分离大鼠大脑皮质神经元长时程单细胞内Ca2+的测定

采用酶解结合机械分离方法,急性分离生后6～7d的SD大鼠的大脑皮质神经元;用Fura-2作为钙离子指示剂,用M40钙离子测量系统(PTI)长时程测量单个细胞内钙离子浓度的变化.以激发光波长340nm和380nm时510nm处的荧光发射强度比率(340/380)显示胞内Ca²⁺浓度的动态变化.     

孕期边缘型维生素A缺乏对NMDA诱导的新生大鼠神经元Ca2+内流的抑制作用

目的 了解孕期边缘型维生素A(vitamin A,VitA)缺乏对氮-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate, NMDA)诱导的新生大鼠海马神经元Ca2+内流的影响.方法 将16只健康雌性Wistar大鼠采用随机数字表法分为边缘型VitA缺乏(MVAD)和VitA正常(VAN)组,每组8只.从交配前3周开始分别饲以VitA缺乏饲料(含VitA 400 IU/kg)和VitA充足饲料(含VitA 6 500 IU/kg).高效液相技术检测血清VitA浓度.取MVAD组及VAN组新生大鼠海马神经元进行原代培养,并运用钙影像测定仪检测原代培养的海马神经元在NMDA刺激后细胞内钙离子变化.Western blot半定量分析海马组织NMDA受体-1(NR1)的表达.结果 MVAD组母鼠血清VitA水平[(0.768±0.069)μmol/L]低于VAN组[(1.284±0.217)μmol/L],MVAD组仔鼠血清VitA水平[(0.806±0.092)μmol/L]低于VAN组[(1.270±0.098)μmol/L](P<0.01);神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolage,NSE)免疫荧光鉴定神经元纯度显示两组无显著差异(P>0.05);MVAD组与VAN组海马神经元在NMDA刺激后,MVAD组Ratio340/380增加值(0.136±0.012)低于VAN组(0.168± 0.022)(P<0.01);Western blot半定量分析结果显示NR1在MVAD组海马组织中的表达显著低于VAN组.结论 孕期开始的MVAD会抑制NMDA诱导的新生大鼠海马神经元钙离子内流,而降低NR1在神经元的表达可能是其损伤的机制之一.     

睾酮对自由基损伤的海马神经元神经保护作用中细胞内Ca2+变化

目的：观测睾酮对自由基损伤的海马神经元神经保护用中是否有细胞内Ca2＋变化。方法：原代培养海马神经元,暴露于自由基并损伤后,分为对照组、不同浓度过氧化氢组、睾酮组;利用荧光探针进行标记,激光共聚焦显微镜下观察加入睾酮前后细胞内Ca2＋变化。结果：以100μM和200μM H2O2组引起细胞内Ca2＋增加最为明显;与对照组相比,Fi值变化差异有统计学意义（P〈0.05）;预先加入睾酮后再暴露于100μM H2O2与单独暴露于相同浓度H2O2组相比,细胞内Ca2＋荧光比值明显降低,二者差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：自由基损伤能引起原代培养海马神经元内Ca2＋含量升高,睾酮能明显减轻由于自由基损伤引起的细胞内Ca2＋变化。     

半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对缺血性损伤后神经元形态的作用

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对原代神经元缺血性损伤后形态变化的作用。方法:在不同浓度孟鲁司特存在条件下,以缺氧缺糖(OGD)2 h和再灌(R)24 h(OGD/R)诱导大鼠原代神经元及皮层混合培养细胞的神经元损伤;以免疫染色法检测神经元数量、胞体大小、胞体总神经突起数量、一级神经突起数量、长度及其分支数量等指标,观察神经元形态的变化。结果:OGD/R可明显减少神经元的数量,显著改变神经元的形态。而孟鲁司特(0.0001～1μmol/L)能减轻单独神经元培养中OGD/R诱导的神经元数量减少,抑制一级神经突起分支数量增加;在混合培养中,孟鲁司特(0.0001～0.1μmol/L)增加OGD/R后一级神经突的长度,减少神经突起数量以及一级神经突起分支数量。结论:半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对大鼠原代神经元缺血性损伤有保护作用。     

8-甲氧沙林对黑素细胞内游离钙浓度及细胞骨架蛋白形成的影响

目的:观察8-甲氧沙林对体外培养黑素细胞内游离钙浓度、细胞骨架蛋白形成的影响.方法:正常人黑素细胞取自包皮环切术切取的包皮,用激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内游离钙浓度,用罗丹明结合毒伞素对细胞骨架蛋白进行特异性染色.结果:8-甲氧沙林可使细胞内游离钙离子浓度升高,促进黑素细胞骨架蛋白合成.结论:8-甲氧沙林可能通过诱导黑素细胞内钙离子浓度升高和细胞骨架actin蛋白生成,从而影响黑素细胞的迁移.     

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+-ATPase活性及ryanodine受体结合反应的影响

目的：观察质粒ＤＮＡ 对离体大鼠骨骼肌肌质网Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ 活性及ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体结合反应的影响。方法：参照Ｊｏｎｅｓ 等的方法比色测定肌质网Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ 活性;以３Ｈｒｙａｎｏｄｉｎｅ 作为配基,液闪测定肌质网Ｃａ２＋ 释放通道ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体与配体的结合。质粒ＤＮＡ 处理组预先将肌质网蛋白与质粒ＤＮＡ３７ ℃共同孵育３０ ｍｉｎ ,而后再测定肌质网Ｃａ２ ＋ＡＴＰａｓｅ 活性和ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 结合反应。结果：预先用１０、２０ 和３０ μｇ ｐｃＤＮＡ３ 及ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ处理后,肌质网Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ 活性分别较对照组升高４５％ （Ｐ＜ ０．０５） ,６８ ％（ Ｐ＜ ０．０１） 和１０９ ％ （ Ｐ＜ ０．０１） 及１０９ ％ ,１１８％ 和１４５％ （Ｐ值均小于０ ．０１） ;质粒ｐｃＤＮＡ３ 可明显降低ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体的亲和力,并使Ｂｍａｘ 增强。结论：质粒ＤＮＡ可能通过增强肌质网Ｃａ２ ＋ＡＴＰａｓｅ 的活性促进肌质网对Ｃａ２ ＋ 的摄入,通过影响ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体而调控肌质网Ｃａ２ ＋ 释放。     

缺氧缺血后脑细胞内Ca~(2+)含量变化及药物干预

目的：了解缺氧缺血后新生鼠脑细胞胞浆及线粒体Ca2+浓度的动态变化及MK-801、硫酸镁、苯巴比妥钠干预对胞浆钙超载的影响。方法：结扎左颈总动脉并吸入8％氧气2h制成缺氧缺血模型，用Fura-2／AM法及原子吸收火烙法测定。结果：缺氧缺血后1h胞浆及线粒体Ca2+浓度均明显升高，24h胞浆Ca2+浓度恢复正常，线粒体Ca2+含量进一步升高，48及72h两者均降至正常；预防性应用MK-801及硫酸镁可抑制缺氧后胞浆钙超载，苯巴比男钠此效果不明显。结论：缺氧缺血可致脑细胞胞浆及线粒体Ca2+浓度增加，硫酸镁和MK-801可抑制缺氧后胞浆钙超载，苯巴比男钠效果不著。     

淫羊藿素抗Aβ肽致大鼠原代培养神经细胞凋亡作用

目的:探索淫羊藿素(icaritin,ICT)对Aβ25-35肽致大鼠原代培养神经细胞的损伤保护作用及潜在机制。方法:制备d17胎龄大鼠胚胎皮层神经细胞,支持培养7d后,与ICT预孵育24h并加入Aβ25-35肽,作用72h后以细胞形态、MTT值、培养液乳酸脱氢酶(LDH)水平作为细胞的损伤指标;并以线粒体膜电位(ΔΨm)改变作为凋亡早期指标,AO/EB染色差异作为凋亡后期指标。结果:0.1μmol·L-1ICT预孵育24h能显著改善10μmol·L-1Aβ25-35肽所致的原代培养神经细胞的损伤,MTT、LDH及形态学结果显示:ICT能提高Aβ25-35肽损伤神经细胞的存活率,JC-1染色结果显示:ICT能防止Aβ25-35肽诱导的细胞线粒体ΔΨm下降,AO/EB染色结果显示:ICT能够改善神经细胞凋亡。结论:ICT经抗凋亡机制对Aβ25-35肽损伤大鼠原代培养神经细胞发挥保护作用。该作用与ICT干预Aβ25-35肽诱导的细胞线粒体膜电位下降和核损伤有关。     

败血症大鼠肝细胞核Ca2+摄取释放功能的改变

目的:观察败血症时肝细胞核Ca2+摄取及释放功能的改变。方法:通过结扎并穿刺盲肠制作大鼠败血症模型,差速离心制备细胞核,进行45Ca2+摄取和释放测定。结果:败血症早期组当介质中游离[Ca2+]为200、400、1000nmol·L-1时,核Ca2+摄取比对照组分别增加35%、95%、160%(P<0.01)。晚期组分别只有对照的87%～88%(P<0.05)。在10μmol·L-1三磷酸肌醇作用下,早期组1min内释出其摄入量的76%,而晚期组仅为52%,与对照组的63%差异有显著性(P<0.01)。结论:败血症时核钙摄取和释放功能呈早期增加,晚期减弱的双向变化。     

早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元Cx36 mRNA表达的远期影响

目的　探讨早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元缝隙连接蛋白Cx36mRNA表达的远期影响。方法　以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型 ,根据对培养 6d皮层神经元的不同处理分为三组 :正常DMEM培养液组 (CONT1)、正常细胞外液组 (CONT2 )和无镁细胞外液组 (MGF)。神经元分别在上述三种液体中孵育 3h ,然后恢复正常DMEM培养液继续培养 ,在培养 7,12及 17d时测定了发育中大鼠皮层神经元早期惊厥样放电后不同时间Cx36mRNA表达。结果　分别与CONT1和CONT2组相比较 ,MGF组Cx36mRNA表达在培养 7d时无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,培养 12d时明显升高 ,17d时明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　早期惊厥样放电可能导致发育中大鼠皮层神经元Cx36mRNA表达的远期影响     

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+转运的影响

目的：观察ＤＮＡ与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网,并用４５ＣａＣｌ２作为示踪剂,观察质粒ＤＮＡｐｃＤＮＡ３和ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ｃａ２＋摄取,呈明显的量效关系,并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒ＤＮＡ可影响肌质网钙转运功能。