乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的体外转录及切？…

日的 研究乙型肝炎病毒特异性核酶体外转录及切割ＨＢＶ的活性。方法 将８１ｂｐ的ＨＢＶ Ｃ基因片段克隆于Ｔ载体Ｔ７启动子下游，＾３２Ｐ标记转录后作国靶ＲＮＡ（＾３２Ｐ－ｒＨＢＶ）。ｒＲ２，ｒＨＤＶＲＺＡ（插入有核酶结构的丁型肝炎病毒基因组重组体）和ｒＨＤＶＲＺＰ（部分ＨＤＶ基因组重组体）进行非标记的大量转录，转录产物经凝胶纯化后，与＾３２Ｐ－ｒＨＢＶ按一定比例和条件保温切割，电泳后放射自显影。     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的体外转录及切割活性

研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）特异性核酶（简称ｒＲＺ）体外转录及切割ＨＢＶ的活性。方法将８３１ｂｐ的ＨＢＶＣ基因片段克隆于Ｔ载体Ｔ７启动子下游，３２Ｐ标记转录后作为靶ＲＮＡ（３２Ｐ－ｒＨＢＶ）。ｒＲＺ、ｒＨＤＶＲＺＡ插入有核酶结构的丁型肝炎病毒基因组重组体）和ｒＨＤＶＲＺＰ（部分ＨＤＶ基因组重组体）进行非标记的大量转录，转录产物经凝胶纯化后，与３２Ｐ－ｒＨＢＶ按一定比例和条件保温切割，电泳后放射自显影。结果ｒＲＺ，ｒＨＤＶＲＺＰ，ｒＨＤＶＲＺＡ在３７Ｃ有活性，并随温度升高而提高，体外观察到重组体的切割活性，证明所设计的核酶结构是正确的。结论将核酶基因插人到ＨＤＶ基因组中，使其具有特异性切割ＨＢＶ的活性，可实现核酶的保护性和靶向性运载，为下一步重组体的体内应用研究奠定了基础。     

不同启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体构建

目的分别构建CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子驱动反式丁型肝炎病毒核酶（HDV核酶）的逆转录病毒表达载体。在这些载体中,HDV核酶设计为靶向HBV基因序列PreS2和C区。方法用PCR技术分别扩增CMV、U2和U3启动子,并连入pMD18-T载体。合成靶向PreS2和C区HDV核酶并利用SalⅠ和H indⅢ的酶切位点分别连入逆转录病毒表达载体pLEGFP（pLEGFP-R z）。然后利用BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点分别把CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子连入重组载体pLEGFP-R z。所有的重组载体经PCR和酶切的方法验证。结果成功地构建了分别含有6种启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体。结论这些重组载体的构建为筛选高效表达核酶的启动子奠定基础。同时这些重组载体也可用于进一步研究HDV核酶抑制HBV复制的效率。     

抗HBV核酶的研究进展

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）是引起乙型肝炎的病原体。在我国ＨＢＶ感染率达１０％，而传统的抗病毒药物远期疗效均不显著，寻找新型抗ＨＢＶ药物成为迫切需要。核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）是一类具有生物催化功能的ＲＮＡ，可定点切割ＲＮＡ靶分子，从而达到有效阻断基因表达的...     

rAAV载体介导的HDV核酶对HBV基因表达的抑制作用

目的探讨重组腺相关病毒介导的HDV核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法将针对HBV基因序列C区的反式HDVR z与U6启动子和绿色荧光蛋白基因EGFP及其启动子CMV共同插入腺相关病毒载体pSNAV中并取代其原有CMV启动子区域,构建为pSNAV-CR z重组载体。并将pSNAV-CR z、pSNAV及pLEGFP质粒转染HepG2.2.15培养细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,对转染后培养细胞内蛋白进行HBeAg和HBsAg的ELISA分析。结果所构建的重组载体经双酶切及PCR验证与实验设计一致。重组载体转染培养细胞后,荧光显微计数表明,pSNAV-CR z的转染效率为30%。HBeAg和HBsAg的ELISA检测显示,pSNAV-CR z重组载体对HepG2.2.15细胞中HBV病毒的HBeAg和HBsAg表达抑制率分别为63.5%和50.07%。结论细胞水平试验证明,重组腺相关病毒载体介导的反式HDVR z在体外培养细胞水平对HBV的复制起到一定的抑制作用。     

HDV核酶对乙型肝炎病毒抑制作用的研究

目的研究HDV核酶在细胞内对乙型肝炎病毒(HBV)复制及其抗原表达的抑制作用。方法1)以HBV前基因组mRNA为靶基因,体外筛选出HDV核酶有效作用位点,构建HDV核酶并进行体外测活;2)分别选用tRNA-Val、U6和hCMV 3种真核启动子,重组构建HDV核酶真核表达载体ptVHRz、pSURz和pcDHRz,分别用3种载体转染HepG2.2.15细胞;3)用点杂交、ELISA和实时荧光定量PCR方法分别检测核酶在细胞内的表达及对HBV的抑制作用。结果在HBV C基因区筛选到一位点,所构建的HDV核酶在体外条件下对该位点能产生有效切割。3种核酶表达载体在细胞内均能高效表达,在转染48 h后,ptVHRz和pcDHRz对HBeAg的表达产生了明显的抑制作用,而对HBsAg没有抑制作用。三者对HBV的复制均未产生明显影响。结论HDV核酶在细胞内对HBV抗原的表达能产生特异性抑制作用,但未能有效抑制HBV的复制,对其原因需进一步深入研究。     

不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性及其意义

目的分析不同长度丁型肝炎病毒核酶的体外自剪切活性.方法用Xba Ⅰ,EcoRⅠ或BamHI将含有HDV.Rz序列的pRz277正向质粒(pRz277A)和pRz277反向质粒(pRz277B)线性化,以α-32p-UTP标志和T7噬菌体RNA聚合酶转录出不同长度的基因组核酶(g.Rz)和抗基因组(即复制中间体)核酶(ag.Rz),在一定条件下进行自剪切反应,然后作聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和放射自显影.结果g.Rz24/100(自剪切位点5和3端分别含24nt和100nt,下同)、ag.Rz38/119在适当条件下绝大部分发生自剪切.g.Rz24/253和ag.Rz38/239也具有一定自剪切活性,但显著低于前两者,即使温度升至55℃或加入去离子甲酰胺也是如此.结论适宜长度的HDV.Rz在体外具有较高的自剪切活性.这些发现有助于我们下一步研究HDV.Rz的反式剪切作用.     

丁型肝炎病毒核酶对丙型肝炎病毒 RNA的抑制活性

核酶 (ｒｉｂｏｚｙｍｅ)是一类具有催化活性的ＲＮＡ分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的ＲＮＡ底物结合 ,并在特定的位点切割底物ＲＮＡ分子[1] 。是基因功能阻断剂 ,被称为“分子剪刀”。美国科学家Ｃｅｃｈ和Ａｌｔｍａｎ分别于 1982年先后发现这种只有催化活性但不含蛋白质的核糖体ＲＮＡ前体和ＲＮａｓｅ的成分[2 ] ,后统一命名为“核酶”。核酶作为基因治疗新药具有如下优点 :1.一个核酶分子可切割多个病毒核酸分子 ;2 .其作用是切断 ,不是单纯抑制 ,停药后复发的可能性小 ;3 .与底物通过碱基配对结合 ,因而有较好的特异性 ;4.针对多…     

腺病毒介导核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用

目的观察针对HBV(乙型肝炎病毒)C区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法采用亚克隆技术,从pGEM—Rz123(含针对HBV C区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于腺病毒表达载体pAd-CMV中。利用Lipofectamine2000介导,将重组病毒pAdCMV—Rz及pAdCMV—laz感染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA(酶联免疫)、免疫荧光、共聚焦定量、图象分析法、Western blot分析Hbe/HBcAg的表达。结果感染的2.2.15细胞2周后,打点杂交证实可表达针对HBV C区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达68.6％,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Western blot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论该双位点核酶通过针对HBV C区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

丁型肝炎病毒核酶结构改建及其对丙型肝炎病毒RNA的剪切活性

目的 观察经过结构改建的丁型肝炎病毒核酶（HDV核酶）对丙型肝炎病毒（HCV）基因组RNA是否存在剪切作用。方法 对HDV基因组核酶的茎IV区和底物结合区进行改建,获得3种针对HCV RNA的HDV核梅RzCI、RzC2和RzC3。体外转录制备含HCV RNA 5′－非编码区（5′-noncoding region,5′-NCR)及部分C区的底物RNA（HCV RNA5′-NCR-C）,进行5′端放射性标记。在一定的pH、温度、Mg^2 浓度和有或无去离子甲酰胺存在等条件下,将核酶和底物按摩尔比100：1混合,反应2h后聚丙烯酰胺凝电泳,放射自显影,推算剪切百分率。结果 RzCI和RzCI2可剪切HCV RNA5′-NCR-C,在适宜浓度的去离子甲酰胺存在时剪切效率较高,RzC3对底物几乎无剪切活性。结果 设计得当的HDV基因组核酶可以剪切异源性RNA分子HCV RNA。     

抗半胱氨酸蛋白酶-7核酶的克隆、体外表达与切割活性的研究

目的 设计并合成抗小鼠半胱氯酸蛋白酶-7(Caspaso7)的锤头状核酶,并对它们的体外表与体外切割活性进行研究。方法 采用计算机软件对锤头状核酶和小鼠Caspase 7基因的二级结构进行分析,核酶的DNA序列在体外由自动合成仪合成,小鼠Caspase-7日的基因通过RTPCR扩增获得,将核酶基因和caspase-7基因分别克隆入载体pBSKneoU6’和pGEM-T中,通过体外转录得到核酶和caspase-7 mRNA,通过体外切割筛选出具有切割活性的核酶。结果 针对目的基因的333和394位点设计合成了两个核酶：Rz333和Rz394。成功获得caspase-7 mRNA的表达载体PC7及含有核酶的重组质粒PU6Rz333和pU6Rz394,通过体外转录表达出含有caspase7mRNA的987nt的靶mRNA及完整的核酶Rz333(47nt)和Rz394(50nt)。体外切割实验证实Rz333能够定点切割caspase-7mRNA,产生243nt和744nt的切割产物,切割效率为67．98％。Rz394不能切割靶基因。结论 核酶Rz333能够位点特异性的切割caspase-7 mRNA。     

丙型肝炎病毒特异性锤头样核酶体外转录及切割活性的初步研究

目的　研究针对丙型肝炎病毒 (HCV)特异性锤头样核酶 (Rz)的体外转录及切割活性。方法　设计 3种锤头样核酶 :Rz1、Rz2 分别作用于HCVRNA 5′ 非编码区 (5′ NCR)上核酸序列 136～16 0、313～ 337,Rz3 作用于核心 (C)区上核酸序列 373～ 388。为区别于反义核酸的封闭作用 ,设计在Rz3 的催化环上存在点变异 (G取代A)的变异核酶Rzm用作对照。体外转录出靶HCVRNA和核酶RNA ,在一定条件下 ,将3 2 P标记的靶HCVRNA与核酶RNA按不同浓度比例进行切割反应 ,电泳后放射自显影 ,通过同位素扫描成像分析仪分析来评价核酶切割效率。结果　除Rzm外 ,在生理温度下 ,3种核酶均有活性 ,并随核酶浓度增加而提高 ;核酶切割靶位点距HCV起始密码子近切割效率高。结论　设计并观察到体外具有HCV特异性切割活性的锤头样核酶 ,为进行核酶的细胞内应用研究奠定基础     

抗Caspase-12核酶的制备与体外活性鉴定

目的 设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中caspase-12mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218)，通过靶基因及核酶的体外转录、切割，进行核酶活性鉴定，评估其应用前景。方法 小鼠Caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增片段克隆于PGEMT载体的T7启动子下游，通过α-^32P UTP标记的体外转录物作为靶RNA。设计合成针对小鼠Caspase-12 mRNA的核酶，通过PCR方法扩增核酶的转录模板，采用非同位素标记法行体外转录，核酶与靶RNA进行体外切割实验。结果在37℃，Rz138、Rz218均有切割活性，Rz138的切割效率较高，几乎100％。结论 Rz138在体外具有良好的特异催化切割活性，它有望通过切割Caspase-12 mRNA而抑制内质网应激介导的细胞凋亡发生。     

逆转录病毒介导核酶基因转移抑制HBV前S2基因表达初探

本文设计合成了针对HBV ayw DNA前S2区第110、122和132位碱基的三靶位串联锤头状核酶基因。经序列分析证明该核酶基因的一级结构与设计序列完全相符。将核酶基因和从含有HBV ayw     

核酶细胞内抗丙型肝炎病毒作用的研究

目的 研究核酶抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的有效切割位点并获得高效、特异、无毒,价廉的ＨＣＶ特异性反式核酶。方法 根据文献报道的序列设计,合成ＨＣＶ５‘非结构（ＮＣ）区和核心（Ｃ）区的特异性反式核酶基因并分别克隆进入真核细胞表达载体ｐＳＶ２－ｇｐｔ．ＣＤ－ＳＲα中,转染ＨＣＶ感染的ＭＴ－２细胞,用定量逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,核酸杂交等方法测定核酶对ＨＣＶ的抑制作用。