恶性疟原虫DNA探针检测血内恶性疟原虫的初步研究

从培养恶性疟原虫(Fcc-1)中分离纯化基因组DNA,用~(32)P标记,作为探针,按DNA斑点杂交法,检测血样。结果表明:该探针可检出9个恶性疟原虫感染红细胞/10_6红细胞;在现场应用时,与13例恶性疟阳性标本镜检符合率为92％:与1例间日疟原虫病例和正常人血、白细胞之间,未发现非特异性杂交。     

用重复DNA克隆作为种特异性探针检测恶性疟原虫DNA

用恶性疟原虫重复顺序克隆进行杂交的方法可提高检测系统的重现性和敏感性。分离疟原虫DNA并用CsCl放线菌素D离心去除人DNA杂质。Tanzania株Ⅰ用Sau 3AI部分酶切并克隆到有Bam HI切点的噬菌体M13mp 18中,用标记的全部恶性疟原虫基因组DNA探针进行噬菌斑杂交选出带有重复顺序的克隆株。用标记的恶性疟基因组DNA探针与人     

质粒PF.rep20探针检测我国恶性疟原虫的初步研究

用~(33)P中标记的质粒PF rep20探针以DNA-DNA斑点杂交检测5种疟原虫,仅恶性疟原虫P.f.呈现阳性反应,间日疟原虫、约氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及诺氏疟原虫不发生杂交;~(32)P标记的P.f.海南株基因组DNA探针与上述诸疟原虫均可发生杂交。基因诊断海南省和云南省恶性疟患者血样本39份的杂交阳性率,质粒探针和基因探针分别为94.9％和97.4％。检测人工培养的海南株、云南株和安徽株P.f.敏感度,质粒探针均为0.001％原虫血症和10Pg原虫DNA,基因组探针对海南株原虫为0.0001％和1Pg。提示质粒PF rep20探针种的特异性强,敏感性较高,似可用于我国恶性疟原虫检测。     

酶联合成的DNA在恶性疟诊断中的应用

本文报道用特异的酶-DNA结合探针检测恶性疟原虫DNA,将DNA杂交技术应用于疟疾诊断。作者采用人工方法合成含21个碱基的低聚物(PFR_1),并在胸腺嘧啶碱基上连接碱性磷酸酶,制备酶-DNA结合探针(PFR_1-AP),再用高压液相色谱法纯化后,4℃贮存备用。PFR_1-AP被用于检测不同量的8种疟原虫DNA、人DNA及冈比亚按蚊DNA,以确定     

不同DNA探针检测疟原虫的灵敏度比较

本文通过分子杂交技术,以恶性疟原虫为靶DNA,对从恶性疟基因文库中筛出的含有高度重复顺序的pBF_4DNA探针和含单考贝基因的pBF_(13)DNA探针以及恶性疟原虫全基因组DNA探针进行了杂交比较,结果pBF_(13)DNA探针比全基因组DNA探针敏感度低10倍,比pBF_4DNA探针敏感度低100倍,全基因组DNA探针可检到的DNA含量为100pg。     

用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的　阐明 Fcc1/ HN株与云南株间的不同生物学特性。　方法　用 M2 6 - 32 作探针 ,筛选恶性疟原虫 c DNA基因表达文库 ,根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物 ,分别进行 PCR扩增 ;地高辛酶促生物标记 Fcc1- HN株 DNA的 PCR扩增产物 ,分别与 Fcc1/ HN株 DNA、云南株 DNA和阳性克隆 5 11的扩增产物杂交。　结果　 PCR扩增后 Fcc1/ HN株 DNA在约 5 0 0 bp和 4 5 0 bp处有 2条特异性条带 ;云南株 DNA在约 5 0 0 bp处有 1条较淡的条带和 130 0bp处一较亮的特异性条带 ;阳性克隆 5 11仅在约 5 0 0 bp处有 1条特异性条带。标记探针能与克隆 DNA、恶性疟原虫Fcc1/ HN株和云南株的 PCR扩增产物杂交。　结论　恶性疟原虫 Fcc1/ HN株与云南株在基因组 DNA结构上可能存在差异。     

用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的 阐明Fccl/HN株与云南株间的不同生物学特性。方法 用M26-32作探针，筛选恶性疟原虫cDNA基因表达文库，根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物，分别进行PCR扩增；地高辛酶促生物标记Fccl-HN株DNA的PCR扩增产物，分别与Fccl/HN株DNA，云南株DNA和阳性克隆511的扩增产物杂交。结果 PCR扩增后Fccl/HN株DNA在约500bp和450bp处有2条特异性条带；云南株DNA在约500bp处有1条较淡的条带和1300bp处一较亮的特异性条带，阳性克隆511仅在约500bp处有1条特异性条带，标记探针能与克隆DNA，恶性疟原虫Fccl/HN株和云南株的PCR扩增产物杂交。结论 恶性疟原虫Fccl/HN株与云南株在基因组DNA结构上可能存在差异。     

间日疟原虫特异性DNA片段的克隆和鉴定

本文从间日疟患者血液中分离出间日疟原虫,将其基因组 DNA 片段克隆到载体 pUC12质粒中,构建了间日疟原虫 DNA 文库。利用质粒的遗传标志初步筛选重组克隆;用~(32)P 标记的间日疟原虫DNA,人白细胞 DNA 和恶性疟原虫 DNA 为探针分别作菌落杂交,差异筛选出4株间日疟原虫特异的重组克隆,命名为 pVA1—4。然后酶切鉴定其插入片段,并用 Southern blot 分析,表明重组质粒 pVAl 含有间日疟原虫特异性 DNA 片段。     

钙对恶性疟原虫入侵人红细胞的作用

作者用几种增加或减少红细胞内、外游离钙技术,观察了钙在恶性疟原虫入侵人红细胞过程中的作用。实验用泰国恶性疟原虫T_9分离株的克隆T_(9/960)用Percoll进行等密度离心分离裂殖体,加入含10%人血清和A型人红细胞的RPMI-1640培养基中连续培养,经4h虫体再侵入新的红细胞后,残存的裂殖体用山梨醇溶解,如此反复3次使虫体培养同步化而获得纯化裂殖体。此外,以PBS洗涤红细胞     

恶性疟原虫0.7kbp中度重复序列的鉴定

重复序列在真核生物基因组中普遍存在,且通常是不编码蛋白质的,其主要功能尚不清楚。本文用DNA重组和PCR的方法研究了恶性疟原虫692bp中度重复序列片段的特性。 以烛缸法培养恶性疟原虫哥伦比亚FCB—2株,从非同步生长的原虫中分离DNA。自恶性疟原虫DNA文库中选出1.4kbp片段(PFCOL692),经EcoRI完全消化后,克隆至质粒pUC18中,然后导入大肠杆菌JM83中。DNA抽提并纯化后,在硝酸纤     

疟原虫核酸探针的制备与应用

核酸探针是现代分子生物学技术中的重要工具,用核酸探针作分子杂交检测疟原虫DNA具有高度的特异性和敏感性,近年来广泛用于疟疾的研究,在DNA文库的筛选、疟疾的基因诊断和虫株的分类鉴定等方面都取得了令人瞩目的成绩。本文就疟原虫核酸探针的制备方法和应用进展作一简要综述。一、核酸探针的制备 1.探针的来源:疟原虫基因组DNA,克隆的DNA或cDNA,由特定DNA转录的RNA,以及合成     

恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列,为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化;恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养;利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列,其片段大小分别为657bp和1,359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照,无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合,从而,为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。     

生物素化质粒PFrep20探针检测恶性疟原虫感染的实验研究

Bio-11-dUTP经切口平移法标记于ρPFrep20探针,自身杂交敏感度为10ρg;检出血培养云南株Pf(恶性疟原虫)和病人血样中Pf密度低限分别为1/10~5和1/10~4(虫/红细胞);病人血样中最低Pf检出数为12000个;检测30份云南省恶性疟患者血样,28份阳性;检测20份云南省和海南省间日疟患者血样、29份正常人血样均为阴性;与三种动物疟原虫及人白细胞的DNA未发现杂交反应。表明ρPFrep20对云南株Pf具高度同源性和特异性,生物素化此探针检测Pf具较高敏感性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序…

本研究通过分离，培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取，纯化基基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ＰＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ＰＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ＰＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ。，     

用特异性DNA探针诊断间日疟

从间日疟原虫(P.v.)DNA基因库中筛选出一P.v.种特异性的DNA探针VPL101。此探针对诊断间日疟,特别是鉴定恶性疟原虫(P.f.)感染中有无P.v.混合感染,具有实用价值。从4例泰国间日疟患者混合血中分离受染红细胞,经皂素溶解和蛋白酶K消化后,抽提并纯化原虫DNA。经Sau 3A部分     

恶性疟原虫特异的基因克隆

本文用鸟枪法将恶性疟原虫基因组 DNA 片段克隆至载体 pBR_(322)质粒中,利用抗性遗传标志和琼脂糖凝胶电泳筛选重组克隆,克隆 pBF_8,pBF_(13),pBF_(23),pBF_(24)用 HindⅢ酶解后,均显示单一插入片段,分子大小分别为1.8,2.3,0.94和6.0kb。经 Southern Blot 和 Dot Blot 分析表明,克隆 pBF_(13)对恶性疟原虫基因组 DNA 特异,与人 DNA 无交叉性杂交,可用作诊断用探针。     

班氏丝虫特异性DNA序列的克隆化及其特性

作者从班氏丝虫微丝蚴DNA基因库中筛选鉴定出一个可作为种特异探针的班氏丝虫DNA序列的克隆pWb35。被鉴定的虫种DNA在一定条件下与~(32)P标记的克隆进行斑点杂交,显影2h后,可见克隆pWb35能选择性地强烈地与班氏丝虫DNA杂交,而另一个克隆pWb67对班氏和马来丝虫都有杂交现象。用Pst Ⅰ和Sac Ⅱ酶酶切pWb35后释出插入的班氏丝虫DNA片段IWb35,其放射标记的特异活性达10~8cpm/μg。用该克隆与多种DNA制备物在硝酸纤维膜上进行斑点杂交试验,结果发现该克隆与100ng的人     

恶性疟原虫大片段DNA在酵母菌人工染色体中稳定克隆

恶性疟原虫大片段DNA在大肠杆菌中克隆不稳定,很可能与恶性疟原虫DNA的A+T含量非常高(82%)有关。酒酿酵母菌与恶性疟原虫的A+T含量较大肠杆菌与恶性疟原虫的A+T接近,因此对100kb以上的恶性疟原虫DNA片段在酵母菌人工染色体(YACs)克隆的稳定性进行了研究。pYAC4经氯化铯标准法纯化,EcoRI和BamHI完全酶切,小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化作为载体DNA。恶性疟原虫B8分离株DNA经EcoRI部分酶切,约15μg埋于琼脂糖井内,用EcoRI部分酶切,然后进行脉冲电场梯度凝胶电泳(PFGE),去除<100kb     

用[α-~(32)P]—dATP标记恶性疟原虫DNA探针诊断恶性疟疾的研究

本文报告从培养的恶性疟原虫提取基因组DNA,以[α-~(32)p]—dATP标记,作为探针,按DNA斑点杂交法检查取自海南省恶性疟患者的血样23份,结果全部呈杂交阳性反应,镜检阳性样本DNA探针检出率为100%,与10例间日疟患者血样全部出现交叉杂交。该探针可检测出恶性疟原虫密度为0.0001%的原虫血症水平,与鼠疟原虫、正常人血和人白细胞无交叉杂交。     

感染伯氏疟原虫的红细胞的脂抗原

疟原虫的红内期通常可改变受感染的红细胞的表面膜,且影响膜内具有重要生物功能的脂类组分。本文报道感染伯氏疟原虫鼠的血清中存在的脂类特异抗体。自感染伯氏疟原虫8～13天的大鼠取血,抗凝,以55%的胶体硅-PBS浓集感染红细胞,后用PBS加以稀释成5%的感染红细胞悬液。以氮减压法释放原虫,尔后将破碎的红细胞于10～40%胶体硅中,经1,900g离心15分钟分层,红细胞膜及其碎片悬浮于10%胶体硅上,游离原虫则见于离心管底沉淀物的界面及完整红细胞中。另以有DNA酶的pH7.5 5mM Na_2HPO_4液4次洗涤渗透性溶解得到红细胞膜,用2:1比例的氯仿