神经节苷脂促进周围神经再生的实验

目的：观察神经节苷脂对冷冻处理后的异体周围神经移植再生的影响。方法：实验于2001-06／2003-12在广西医科大学中心实验室完成。选取健康成年新西兰大白兔36只，取4只作为供体，切取双侧坐骨神经，制成10mm神经段，深低温冷冻储存2周备用。其余32只作为受体，随机分为神经节苷脂组与正常对照组，16只／组，将兔左侧坐骨神经造成10mm长缺损，用复温后的同种异体神经进行移植桥接。神经节苷脂组每天每只局部注射质量浓度为1g／L的神经节苷脂溶液1mL，连续14d；正常对照组不做任何处理。两组分别于术后2，4，8，12周随机取4只进行电生理检查、组织学观察、超微结构观察、肌肉湿重测定以及形态学定量分析。结果：作为受体的32只兔全部进入结果分析，中途无脱落。①两组兔术后大体观察比较：正常对照组均有足底及足趾溃疡，神经节苷脂组有6只发生足跟溃疡。两组动物左后肢均无力，行走不稳。②两组兔术后不同时期电生理检测结果比较：与正常对照组传导速度、电位波幅比较，术后2，4，8周神经节苷脂组基本无变化（P〉0．05），术后12周明显升高[（28．62&;#177;2．42），（21．78&;#177;2．43）m／s；（5．48&;#177;0．36），（4．67&;#177;0．53）mV；P均〈0．05]。③两组兔术后不同时期组织学观察结果比较：术后2周，正常对照组有髓神经纤维髓鞘崩解，许旺细胞增生不明显；神经节苷脂组崩解反应较正常对照组慢，许旺细胞增生明显。术后4周，正常对照组许旺细胞增生活性低，有髓神经纤维密度低；神经节苷脂组许旺细胞增生活跃，有髓神经纤维密度较大；术后12周，正常对照组有髓神经纤维数量少，神经束膜间毛细血管增生明显，神经纤维瘢痕化明显；神经节苷脂组有髓神经纤维数量较多，有少许神经纤维瘢痕化，神经束膜间毛细血管清晰。④组兔术后12周超微结构观察比较：正常对照组可见结缔组织无定形结构中夹杂少量变性神经纤维，轴突电子密度低且有空泡，许旺细胞细胞器及有髓轴突稀少，部分再生轴突及髓鞘发生wallerian变性脱髓；神经节苷脂组可见大量神经纤维髓鞘增厚和雪旺氏细胞细胞器更丰富，轴突电子密度深且均匀，许旺细胞外有完整基膜包绕，变性神经纤维少。⑤两组兔术后不同时期肌肉湿重Guadros指数的测定：术后4，8，12周，神经节苷脂组均明显高于正常对照组俨均〈0．05），表明正常对照组肌萎缩较重。⑥两组兔术后不同时期再生神经纤维各项指标测定结果比较：与正常对照组有髓神经数目、纤维直径、髓鞘厚度及轴突直径比较，术后2，4，8周神经节苷脂组基本无变化（P〉0．05），术后12周均明显高于正常对照组[（2183．6&;#177;184．3），（1520．2&;#177;124．3）个／400倍视野；（16．45&;#177;1．86），（10．08&;#177;1．62）μm；（6．48&;#177;0．72），（4．72&;#177;0．56）μm；（4．40&;#177;0．42），（3．04&;#177;0．34）μm；P均〈0．05]。结论：再生神经能够顺利地通过移植体进入远端，使再生神经传导速度、有髓神经纤维数目、肌湿重等指标明显升高，证明免同种异体神经经冷冻处理后桥接神经缺损可引导神经纤维再生，且外源性神经节苷脂可促讲异体祷槽周围神绎的再生。     

周围神经放射线照射后原位再植再生功能与组织学的恢复

目的:观察大鼠体外坐骨神经节段经放射线照射后原位再植再生功能与组织学影响。方法:实验于2004-05/09在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物实验中心完成,选择清洁级5月龄雌性大白鼠26只,其中2只编号为1、2号。余24只随机分为3组,对照组,单纯手术组和4500cGy照射组,每组8只。制备模型,单纯手术组切取右腿坐骨神经中段10mm后原位再植;4500cGy照射组坐骨神经节段离体以4500cGy高能射线一次照射后原位再植。1号鼠神经节段同单纯手术组处理,2号鼠同自体神经移植4500cGy照射组处理,完毕后即行标本固定,光镜、电镜观察。对照组鼠不给以干预处理,各组大鼠术后饲养12周进行一般情况观察及大鼠坐骨神经功能测定、胫前肌定量分析与组织学评价。结果:纳入实验大鼠26只,无动物死亡,均进入结果观测与分析。①术后12周单纯手术组和4500cGy照射组的坐骨神经功能指数显著低于对照组正常对照值[(-33.41±2.99),(-11.23±2.38),q=22.62,P<0.05];[(-34.63±2.91),(-11.23±2.38),q=23.87,P<0.05]。神经纤维数量多于对照组正常值[(192.50±21.00),(203.00±16.94),(174.13±10.18)×102根/mm2]。②组织学变化的光镜观察结果:1号鼠神经结构完整,神经纤维排列规则,髓鞘无肿胀;2号鼠4500cGy高能X射线照射后,神经纤维轻度空泡样变,轴索见境界尚清,髓鞘轻度肿胀,无髓鞘脱失。术后12周末对照组为正常神经组织;单纯手术组神经束毛细血管增生不明显,髓鞘无明显肿胀。4500cGy照射组神经纤维粗细基本一致,排列尚规则,少量炎性细胞浸润和纤维组织增生。③坐骨神经的组织学变化的电镜观察结果:1号鼠髓鞘多呈椭圆形,明暗相间板层结构清晰可见,轴索结构完整,神经膜细胞内见丰富的线粒体、粗面内质网等结构。2号鼠可见髓鞘板层结构轻度空泡样变,细胞核基本完好。术后12周末对照组神经呈椭圆形,髓鞘壁薄厚一致,板层结构致密,轴浆内富含神经微丝和微管,许旺细胞核少见;单纯手术组和4500cGy照射组均可见神经轴突发育良好,呈近似椭圆形,髓鞘壁薄,许旺细胞核多见,轴索内见线粒体。结论:经4500cGy高能射线一次照射大白鼠坐骨神经体外节段原位再植,神经干再生结构与功能恢复完全,可最大限度保存神经干再生能力。实验条件下,体外放射灭活处理法作为神经保存的方法是可行的。     

副神经移位修复第5颈椎神经根和臂丛神经上干的可行性

目的:应用小间隙的方法行副神经移位修复C5、臂丛神经上干,以了解副神经移位后的效果及节省动力神经源的可行性。方法:实验于2004-09/12在吉林省外科研究所实验室进行,取40只雄性Wistar大鼠,随机分成两组,每组20只:A组:自体颈静脉桥接行副神经小间隙(2mm)移位于C5神经根,B组:自体颈静脉桥接行副神经小间隙(2mm)吻合于臂丛神经上干,两组均是左侧为正常侧,右侧为实验侧。术中测量副神经、C5神经根和臂丛神经上干的直径;术后12周行电生理学观察两组大鼠肱二头肌、三角肌肌电图波幅和潜伏期;神经组织学和图像观察再生神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度;透射电镜观察再生神经纤维形态。结果:两组40只大鼠均进入结果分析。①神经直径:副神经主干为(0.45±0.05)mm,C5神经根为(0.66±0.11)mm,臂丛神经上干为(1.16±0.14)mm。②肌电图波幅和潜伏期:术后12周A组肱二头肌、三角肌实验侧和正常侧比较无差异(P>0.05);B组肱二头肌实验侧和正常侧比较无差异,三角肌实验侧较正常侧潜伏期长,波幅低(P<0.05)。③再生神经纤维数目:术后12周A组实验侧和正常侧比较无差异(P>005),B组实验侧明显少于正常侧犤(99.60±22.61),(134.40±30.62)个,t=8.26,P<0.01犦。④轴突直径:术后12周A组实验侧和正常侧比较无差异(P>0.05),B组实验侧明显小于正常侧犤(1.38±0.40),(2.88±0.62)μm,t=19.35,P<0.01犦。⑤髓鞘厚度:术后12周A组实验侧和正常侧无差异(P>005),B组实验侧明显小于正常侧犤(0.92±0.22),(1.75±0.61)μm,t=5.98,P<0.01犦。⑥再生神经纤维形态:A组再生的有髓神经纤维数多,有髓神经纤维髓鞘厚度厚,神经束膜结构完整。B组有髓神经纤维数目明显少,束膜结构不完整,有髓神经纤维鞘可见板层样分离。结论:①应用副神经移位可以修复C5神经根损伤,由于副神经直径相当于C5神经根直径的68%,可以节省动力神经源。②而副神经移位修复臂丛神经上干因两者直径差异明显,副神经只相当于臂丛神经上干直径的39%而不能修复上干。     

许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的:观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤的促进作用,为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。方法:实验于2004-04/2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只,体质量180～220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组,每组8只。分笼饲养。另纳入5～8d龄Sprague-Dawley乳鼠40只,取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞;许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后,应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处,自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。结果:Wistar大鼠24只全部进入结果分析,没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀,轴索略粗,髓鞘厚度有差别,部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构,许旺细胞包绕神经纤维,轴索内微丝微管结构较清晰,无髓神经纤维直径较小,不均匀分布在有髓神经纤维之间,由一层纤维结缔包裹形成纤维束,实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄,自体移植组再生神经纤维均较粗,许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘,髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形,并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率(有髓纤维总面积/神经干总面积)接近自体移植对照组,差异无显著性意义[(5344±592),(5514±373);(3.13±0.16),(3.19±0.25)μm;(48.43±3.62)%,(57.11±2.28)%;P>0.05];与空白对照组比较差异有显著性意义[(5344±592),(3191±236);(3.13±0.16),(1.28±0.33)μm;(48.43±3.62)%,(31.05±4.19)%;P<0.05]。结论:与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生,促进神经损伤修复,是临床修复神经缺损的可行办法。     

坐骨神经损伤后近端以不同比例吻合后的组织学和图像特征

目的:通过将损伤后坐骨神经近端以不同比例与远端小间隙吻合后的再生神经的组织学和图像分析,了解再生神经要达到原有两端直接吻合的效果,近端至少需原神经的多大比例。方法:实验于2004-09/12在吉林省外科研究所进行。成年Wistar大鼠90只,随机分成5组,每组右侧坐骨神经切断后分别取坐骨神经近断端的1/4(1/4组)、1/3(1/3组)、1/2(1/2组)、2/3(D组)和整个近断端(对照组)以小间隙(2mm)自体静脉桥接的方法与远端吻合,术后12周行组织学和图像分析。结果:90只大鼠均进入结果分析。①再生神经轴突直径、髓鞘厚度及神经纤维数:1/4组与对照组相比差异有非常显著性意义[轴突直径:(1.54±0.48),(2.53±0.87)μm;髓鞘厚度:(0.85±0.21),(1.44±0.44)μm;神经纤维数:(97.40±14.76),(167.00±33.58)根,(P<0.01)]。②1/3组与对照组相比差异有显著性意义[轴突直径:(1.78±0.58),(2.53±0.87)μm;髓鞘厚度:(0.77±0.17),(1.44±0.44)μm;神经纤维数:(112.39±18.47),(167.00±33.58)根,(P<0.05)]。③1/2,2/3两组与对照组相比差异无显著性[轴突直径:(2.22±0.73),(2.38±0.82),(2.53±0.87)μm;髓鞘厚度:(1.20±0.34),(1.33±0.41),(1.44±0.44)μm;神经纤维数:(133.41±20.65),(152.98±19.58),(167.00±33.58)根,(P>0.05)]。结论:在应用小间隙(2mm)自体静脉桥接缝合坐骨神经时,近端坐骨神经达到其1/2以上比例时再生神经数、轴突直径和髓鞘厚度与原有神经直接吻合的结果无明显差异。     

许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的：观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤舯促进作用，为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。 方法：实验于2004-04／2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只，体质量180-220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组，每组8只。分笼饲养。另纳入5-8d龄spmgue-Dawley乳鼠40只，取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞；许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后，应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。 结果：Wistar大鼠24只全部进入结果分析，没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀，轴索略粗，髓鞘厚度有差别，部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构，许旺细胞包绕神经纤维，轴索内微丝微管结构较清晰，无髓神经纤维直径较小，不均匀分布在有髓神经纤维之间，由一层纤维结缔包裹形成纤维束，实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄，自体移植组再生神经纤维均较粗，许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘，髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形，并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率（有髓纤维总面积／神经干总面积）接近自体移植对照组，差异无显著性意义[（5344&;#177;592），（5514&;#177;373）；（3．13&;#177;0．16），（3．19&;#177;0．25）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（57．11&;#177;2．28）％；P〉0．05]；与空白对照组比较差异有显著性意义[（5344&;#177;592），（3191&;#177;236）；（3．13&;#177;0．16），（1．28&;#177;0．33）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（31．05&;#177;4．19）％；P〈0.05]。 结论：与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生，促进神经损伤修复，是临床修复神经缺损的可行办法。     

许旺细胞源神经营养因子肌肉注射对端侧吻合后神经再生的影响

目的:观察分析肌肉注射许旺细胞源神经营养因子能否提高端侧吻合后再生神经的质量。方法:①实验选取清洁级雌性SD大鼠24只,随机数字表法分为许旺细胞源神经营养因子组、生理盐水对照组,12只/组。每组大鼠均随机切断一侧腓总神经,与胫神经外膜开窗处行端侧吻合,另一侧作为正常对照。②术后许旺细胞源神经营养因子组于神经端侧吻合的小腿外侧肌肉注射100mg/L许旺细胞源神经营养因子,1次/周,共4周。生理盐水对照组于相同位置注射0.1mL生理盐水,方法和疗程同上。两组作为正常对照的右侧神经不作任何处理。③术后12周,两组大鼠行腓总神经电生理特性检测、组织学检查及胫前肌湿重测定。结果:实验选取清洁级雌性SD大鼠24只,全部进入结果分析。①两组术后12周电生理检测结果:与生理盐水对照组比较,许旺细胞源神经营养因子组端侧吻合侧的神经传导速度加快[(17.33±1.59),(23.14±1.42)m/s,P<0.05],相应的潜伏期则缩短[(8.54±0.63),(5.57±0.78)ms,P<0.05],且复合肌肉动作电位振幅升高[(2.35±0.51),(3.77±0.49)mV,P<0.05]。②两组术后12周胫前肌湿重及腓总神经纤维数量测定结果:许旺细胞源神经营养因子组胫前肌湿重比值及腓总神经纤维数量比值均显著高于生理盐水对照组(0.785±0.152,0.515±0.132;0.747±0.126,0.453±0.151;P<0.05)。③两组术后12周组织学检查结果:与生理盐水对照组比较,许旺细胞源神经营养因子组端侧吻合侧再生的腓总神经横切面神经纤维数目相对较多,神经纤维粗,排列相对较齐,髓鞘厚,束间有少量结缔组织。结论:肌肉注射许旺细胞源神经营养因子可在一定程度上提高端侧吻合后再生神经的质量。     

周围神经损伤后不同时间的修复比较

背景:大量实验证明,Bungner带-许旺细胞-基底膜结构是神经再生理想的微环境.这一结构在神经损伤两三周后形成.而在神经损伤数小时后,近断端的神经纤维就开始发芽再生神经纤维开始再生与所需微环境的形成并不同步.目的:观察周围神经损伤后不同时间进行修复的最佳效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-06在哈尔滨医科大学动物实验中心完成.材料:新西兰大白兔20只,随机数字表法分为4组:2周后神经修复组、4周后神经修复组、3个月后神经修复组、即时神经修复组.方法:建立成年新西兰大白兔周围神经损伤模型,即时修复组立即缝合伤口,2周后神经修复组、4周后神经修复组、3个月后神经修复组采用神经两断端分别固定于肌膜上,逐层缝合伤口,2周,4周,3个月后重新打开伤口,在手术显微镜下用10-0无损伤尼龙针线进行外膜缝合修复坐骨神经,缝合伤口.主要观察指标:各组缝合神经段的神经电生理、轴突数、光镜及电镜观察结果.结果:2周后神经修复组神经传导速度慢于4周后神经修复组、3个月后神经修复组(P＜0.01);即时神经修复组与2周后神经修复组差异无显著性意义(P＞0.05).2周后神经修复组效果最好,神经纤维走行正常、排列完好,神经纤维可见血管增生,髓鞘结构较好,许旺细胞功能活跃,新生轴突内微缝密集排列.4周后神经修复组最差,神经纤维数量少、排列紊乱,髓鞘轴突变性明显,大部分神经纤维脱髓鞘崩解,轴突消失,未见再生神经纤维.3个月后神经修复组效果较差,可见较多神经纤维结构破坏,捧列略紊乱,髓鞘和轴突变性较明显,仅见少量再生神经纤维,许旺细胞略少,胞质不发达.即时进行神经修复组效果较好,神经纤维结构破坏不明显,排列整齐,髓鞘和轴突变性轻,神经纤维内见有大量再生髓鞘,许旺细胞明显增多,胞质较发达.2周后神经修复组轴突计数优于其他3组(P＜0.05),4周后神经修复组最少.结论:神经损伤2周后进行神经修复效果优于其他时间点,是周围神经损伤后修复的最佳时机.     

转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响

背景周围神经缺损多采用自体神经移植,但存在一些问题,许多学者尝试异体神经移植,但存在许多问题,免疫排斥反应就是其中之一.目的观察局部应用转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响.设计随机对照的实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料实验于2001-08/2002-10在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.选择健康成年不同窝的Wistar大鼠60只,随机分为实验组、空白组、对照组3组,每组20只.方法制备转化生长因子β1质粒待用.制备动物模型,将两组大鼠的坐骨神经在梨状肌孔下0.5 cm处,用消毒的剃须刀片整齐切断并切除2.0 cm,切除的神经段互换移植修复神经缺损,实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒,空白组、对照组注射等量的生理盐水,实验组、空白组不使用任何药物,对照组给予环孢霉素A(15 mg/kg)喂养.分别于6周和12周各取10只取材、切片、染色染色①Gleesluxotfast blue法染色.②髓鞘坚牢蓝染色法.轴索计数术后12周的移植体中段染色标本,随机取视野,在光镜400倍下计算1.0mm2内轴索数.组间比较采用t检验.主要观察指标各组移植区形态学观察和轴突计数.结果实验动物数量分析60只动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①空白组可见移植物的不同地方出现广泛的单核细胞浸润,髓鞘脱水,可见大量的空泡变性,以6周时最为明显,整个移植物均被单核细胞浸润,排异反应严重,在移植段中,有极少量的轴突再生.12周时,移植体变细,大量瘢痕组织增生,水肿明显,可见极少量的许旺氏细胞和再生轴突,绝大多数再生的轴突未通过整个移至段.实验组、对照组有少量的单核细胞浸润,水肿较明显,但可见新生的血管在移植神经中形成,再生的轴突通过移植体.6周时,可见较多的许旺氏细胞增生.12周时,再生轴突已通过移植体,有一定量的髓鞘形成,许旺氏细胞增生明显,轴索间水肿减轻.各组移植段中外周的神经再生的轴突数量和髓鞘再生的数量较中心的多,且实验组中外周的轴索间水肿较中心的明显减轻.②术后12周,每组各取5只大鼠,在神经移植体中段随机取视野,400倍显微镜下观察计算1.0 mm2内轴突数,实验组、对照组轴突数显著高于空白组,组间差异有极显著性[(78.3±4.6),(76.1±4.2),(15.0±3.5),t=3.056,t=2.948,P＜0.01].实验组和对照组接近,差异无显著性[(78.3±4.6),(76.1±4.2),t=1.982 P＞0.05].结论局部使用转化生长因子β1质粒,可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应.并使移植体轴突数增多,促进神经生长.     

感觉神经端侧吻合后再生纤维的功能

目的:应用两种电生理技术,评价感觉神经端侧吻合后再生神经的功能。方法:取兔(新西兰兔15只,雌雄不拘,随机分为实验组、对照组和正常组,每组5只)耳大神经移植体作为受神经,与对侧耳大神经端侧吻合并植入皮瓣。用神经单纤维放电引导电生理技术检测皮瓣内再生放电纤维数量、分布、感觉类型。同时以免(新西兰兔16只,雌雄不拘,随机分为10,20,30周实验组和正常对照组,每组4只)2条耳大神经作端侧吻合模型,用RM-6280多道智能生理记录及分析处理系统测定再生纤维动作电位幅值恢复率和神经传导速度。结果:植入皮瓣的受神经在术后4个月可再生触、压、痛、温冷觉末梢,使皮瓣初步建立神经再支配。受神经内再生纤维的动作电位幅值恢复率10,20,30周时分别为(53.0±3.7)%,(66.8±5.5)%,(88.8±2.3)%;神经传导速度10,20,30周时分别为(42.4±1.6),(55.6±1.2),(57.2±1.6)m/s,随时间延长逐步增加。术后30周受神经近端再生纤维幅值恢复率和传导速度分别达到正常的88.8%和94.38%。结论:感觉神经端侧吻合后能再生有功能的神经纤维,再生速度稍慢。