新型脱细胞脑组织修复支架的制备及其细胞相容性

 【目的】研制天然脱细胞脑组织修复支架,并对其形态结构、主要成分和细胞相容性进行分析,为研制出理想的脑损伤修复支架提供初步的实验依据。【方法】取成年Sprague-Dawley （SD）大鼠脑皮质,运用冻融、Triton X-100、脱氧胆酸钠、DNA/RNA酶等进行脱细胞处理并予京尼平（Genipin,GP）交联,对处理后的支架材料进行形态结构观察、主要成分分析和细胞相容性观察。【结果】经脱细胞处理后,脑组织细胞成分已去除,形态上具有高度仿生的三维立体空间网状结构。经GP交联后脱细胞支架空间网状结构变得更为明显,无菌保留3个月未见明显降解。平均孔径（14.9±2.5）μm,孔隙率达（90.4±2.2）％。脱细胞支架细胞外基质成分层粘连蛋白(Laminin,LN)强阳性表达、纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）和Ⅳ型胶原（Collagen Ⅳ,Col Ⅳ）弱阳性表达。神经干细胞与脱细胞支架共培养,HE可见细胞外基质支架间大量细胞粘附; SEM下可见大量神经干细胞粘附在支架材料表面,部分细胞表面有突起。【结论】初步研制的脱细胞脑组织支架呈立体空间网状结构,部分保留了细胞外基质成分,并具有良好的细胞相容性。     

灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究

目的 探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性.方法 取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道.灌注压强为100 cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TdtonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液.经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分.结果 所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仪见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光.结论 灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架.     

低免疫原性脱细胞神经基质的制备及其理化性能

目的：制备低免疫原性异种脱细胞神经基质并评估其理化性能。方法：以α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪坐骨神经为实验原料对基因敲除猪坐骨神经进行脱细胞处理制备低免疫原性异种脱细胞神经基质，通过HE、DAPI染色及DNA残留量检测评价神经组织的脱细胞效果；I型胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白免疫组织化学及天狼猩红染色评价脱细胞神经细胞外基质组分保留情况；α-1，3-半乳糖基（a-gal）免疫荧光检测异种抗原a-gal的残留；扫描电镜（SEM）分析脱细胞神经三维组织结构及孔隙率。结果：组织染色显示脱细胞神经基质内膜、外膜、束膜中的细胞均去除干净，DNA定量结果显示DNA含量下降了95%。天狼猩红染色及免疫组织化学结果显示脱细胞神经组织较好地保留了胶原纤维与细胞外基质主要蛋白。SEM结果显示脱细胞神经较好地保留了其三维组织结构，细胞毒性检测表明脱细胞神经基质无细胞毒性。结论：本研究自主设计的四联脱细胞方案能彻底去除神经组织中的细胞成分与异种抗原，并且较完整地保留了神经组织结构，与天然神经具有高度相似性。     

脱细胞脊髓支架的成分分析

目的 探讨同种异体脱细胞脊髓支架的制备方法并分析其可能含有的有效成分.方法 采用冻融 化学萃取方法制备脱细胞脊髓支架,光镜及扫描电镜观察其结构特征;用免疫组织化学法分析脱细胞支架的主要成分.结果 正常的大鼠脊髓组织经脱细胞处理后,清除了所有的细胞成分及髓鞘和轴突,扫描电镜显示保存了细胞外基质成分构成了三维支架结构.成分分析结果显示,存留的支架结构中含有层黏连蛋白(laminin, LN)、纤连蛋白(fibronectin, FN)、Ⅳ型胶原等诱导和促进神经再生、促进细胞黏附和增殖的重要成分.结论 脱细胞异体脊髓具有三维支架结构,含有诱导和促进神经再生的相关蛋白,有利于受损神经的再生及移植细胞的存活和增殖.     

组织工程猪膀胱无细胞基质的制备

目的探讨猪膀胱无细胞基质制备的方法及其作为生物支架材料应用于组织工程膀胱构建的可行性。方法分别采用酶消化法和去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理并进行HE染色及电镜检查。应用MTT法进行细胞毒性测定。对5只新西兰兔行大部分膀胱切除术后,采用异种膀胱无细胞基质修补,6周后取材观察修复组织再生情况。结果两种方法均能去除膀胱中细胞成分,光镜及电镜观察无细胞成分残留,细胞毒性测定为1级,细胞相容性好。兔膀胱修补后6周支架材料上有移行上皮及肌肉组织生长。结论经脱细胞处理的猪膀胱无细胞基质具有良好的组织相容性,有作为组织工程膀胱支架材料的应用前景。     

大鼠肾脱细胞支架的制备研究

背景 基于完整天然肾的脱细胞支架可以用于生物人工肾,然而目前对肾脱细胞支架的制备没有统一的标准.由于脱细胞的结果直接关系到再细胞化和肾功能的发挥,因此对脱细胞支架的制备方案进行探索和优化显得尤为重要.目的 探究基于大鼠完整肾的脱细胞支架制备方案,为组织工程肾的制备提供生物支架材料.方法 通过给离体肾灌注十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液洗脱肾内的细胞成分制备大鼠肾脱细胞支架,病理染色及透射电镜观察组织结构及细胞外基质保留情况,超声和超声造影观察支架完整性和血管网络通畅性,DNA和SDS定量检测支架内的核酸和洗脱剂的残留,细胞毒性检测脱细胞支架的安全性.结果 脱细胞时间随着灌注流速增加而减少,高流速灌注洗脱肾造成鲍曼氏囊面积变大而导致鲍曼氏囊破裂,且有细胞核成分残留.低流速下制备的脱细胞支架结构完整、细胞成分洗脱干净.0.5 mL/min流速下液体环境中灌注洗脱制得的脱细胞支架结构完整,DNA和SDS残留符合标准,超声探查见脱细胞支架完整,造影检查见完整血管网络,支架无细胞毒性.结论 制备大鼠肾脱细胞支架的最佳灌注流速是0.5 mL/min,超声和超声造影检查可以作为评价肾脱细胞支架的手段.     

碳化二亚胺交联并肝素化的血管脱细胞基质的组织相容性

目的应用碳化二亚胺交联同种异体犬颈总动脉脱细胞基质,并且利用其双功能交联特性将肝素共价结合于脱细胞基质上,评价其组织相容性。方法应用多步骤除垢剂-胰酶作用制备犬颈总动脉脱细胞基质,按脱细胞基质、碳化二亚胺和肝素的质量比1∶2∶1制备交联并肝素化的脱细胞基质,采用甲苯胺蓝染色法定性检测肝素结合;采用细胞毒性四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测其细胞相容性;采用大鼠皮下埋植实验检测其体内组织相容性,并进行免疫组织化学和透射电镜检测。结果碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质的形态和强度无明显变化,甲苯胺蓝染色定性地显示了肝素与支架的结合;细胞毒性实验显示碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质浸提液提高了内皮细胞的增值率;大鼠皮下埋植实验显示,交联并肝素化的脱细胞基质有良好的组织相容性,并且促进成肌纤维细胞浸润。结论碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质具有良好的组织相容性,同时能够促进细胞的再分布过程。     

复合软骨修复材料支架的构建

目的：构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法：对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果：天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论：通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。     

家猪脱髓核细胞基质的制备及其生物相容性评价

目的:制备家猪脱髓核细胞基质并评价其生物相容性。方法:分离家猪脊柱髓核组织,并逐步经过胰酶、核酶及TritonX-100处理,得到脱髓核细胞基质,DAPI染色观察脱细胞效果及扫描电镜观察脱髓核细胞基质的物理形态特点,将脱髓核细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜,将大鼠骨髓间充质干细胞接种于基质膜上培养。在第1～5天采用CCK-8检测骨髓间充质干细胞在脱髓核细胞基质膜上的增殖情况,并计算细胞相对增殖率(RGR)来评价其生物相容性。结果:制备出的家猪脱髓核细胞基质肉眼呈白色糜状,DAPI染色发现无细胞残留。扫描电镜下观察发现,脱髓核细胞基质由无序排列的胶原纤维组成。通过CCK-8检测,5 d内细胞毒性分级在0级与2级之间。结论:家猪正常髓核组织能够进行脱细胞处理,且脱细胞后由无序的胶原纤维组成。脱髓核细胞基质具有很好的生物相容性,符合生物工程支架选材标准。     

细胞外基质和整合素β1在非小细胞肺癌中的表达和意义

目的研究细胞外基质中纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白和整合素β1在人非小细胞肺癌组织中的表达特征及意义.方法采用免疫组化EnVision法,检测57例非小细胞肺癌组织中细胞外基质和整合素β1的表达.结果在非小细胞肺癌中纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白广泛（≥50%切片区域）表达率分别为80.7%、71.9%和42.1%,整合素β1阳性表达率为43.9%.纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白和整合素β1在57例肿瘤标本中阳性表达率显著高于在23例正常肺组织的阳性表达率（P＜0.05）.在非小细胞肺癌中,层黏连蛋白在中高分化组的阳性表达率显著高于低分化组（P＜0.05）.Ⅳ型胶原蛋白在肺腺癌表达率显著高于在肺鳞癌的表达率（P＜0.05）;层黏连蛋白在肺鳞癌的表达率显著高于在肺腺癌表达率（P＜0.05）.无淋巴结转移组的层黏连蛋白的表达率显著高于淋巴结转移组（P＜0.05）,整合素β1在淋巴结转移组表达率显著高于无转移组（P＜0.05）.结论细胞外基质和整合素β1在非小细胞肺癌组织中有高表达;层黏连蛋白高表达可能提示肿瘤恶性程度较低及淋巴结转移发生低,并与鳞癌发生有关;Ⅳ型胶原蛋白高表达可能与腺癌发生有关;整合素β1高表达则可能促进癌细胞侵袭转移.     

大鼠子宫去细胞化支架的制备和评价

目的：通过去细胞化灌注技术,探讨成功制备天然子宫去细胞化生物支架的理想灌注策略,并通过系统的评价体系,以鉴定其能否作为子宫组织再生工程研究的良好应用载体。方法：选择健康成年雌性SD大鼠,采用子宫动脉入路途径,通过冻融、酶解及曲亚通（TritonX-100）联合十二烷基硫酸钠（SDS）的洗脱灌注等流程,获取子宫去细胞化支架。并通过大体形态观察、美兰染色、HE染色观察、基因组DNA定量分析、EGF、bFGF、TGF-β含量测定、电镜观察、胶原蛋白总量检测及主要胶原成分鉴定等对去细胞化后的子宫支架进行全面的评价。结果：成功建立动脉灌注入路并获得了肉眼透明的子宫去细胞化支架,HE染色和透射电镜观察均表明去细胞化子宫支架内无细胞残留,DNA含量检测表明支架内DNA残留量为（45.6±7.3）ng/mg,不足正常子宫的5%（P＜0.01）,美兰染色和扫描电镜显示子宫支架的脉管网络和空间结构保存完整;而胶原蛋白含量由新鲜子宫组织的（0.57±0.12）μg/mg增加到去细胞化子宫支架的（0.88±0.10）μg/mg,差异有统计学意义（P＜0.05）,结合各型胶原的免疫组织化学定性分析,说明去细胞化后子宫支架的细胞外基质成分保留得较为完整;ELISA结果显示去细胞化子宫支架中细胞因子EGF、bFGF和TGF-β分别保留了66%、85%和54%,表明其仍具备一定的生物活性。结论：本研究方法能够成功制备理想的去细胞化子宫支架,并且支架的基质成分和理化特性完整保留,能够作为子宫组织工程研究的良好载体。     

脱细胞血管基质的生物相容性研究

目的评估Triton X-100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞血管基质的生物相容性。方法分别采用体外细胞毒性试验(直接接触法和MTT法)检测脱细胞血管基质的细胞毒性,采用皮下植入试验来评估经脱细胞血管基质的免疫排斥反应。结果L929细胞在预铺脱细胞血管基质的培养板内及不同浓度脱细胞基质浸提液内均生长良好,皮下植入试验显示2周后脱细胞血管基质的炎性反应明显减轻。结论经Triton X-100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞血管基质具有良好的生物相容性。     

肝细胞、肝窦内皮细胞分离培养及肝细胞支架的制备

目的：探究大鼠肝细胞、肝窦内皮细胞的分离培养方法及肝去细胞支架的制备方法。方法：用胶原酶IV消化肝脏组织后经洗涤、过滤、离心等步骤分离出大鼠肝细胞,然后置于培养基内进行纯化、培养后行细胞免疫组织化学检测;通过Percoll密度梯度离心法分离出肝窦内皮细胞置于培养基内纯化、培养后行免疫荧光检测;肝组织经循环灌注去细胞处理制备成大鼠肝细胞去细胞支架后经扫描电镜证实。结果：分离出的大鼠肝细胞在显微镜下呈光亮圆形,饱满,胞核清晰。肝细胞细胞角蛋白18免疫组织化学染色后见胞浆内存在棕黄色颗粒。肝窦内皮细胞呈梭形,细胞核位于中央。内皮素-1免疫荧光染色后细胞表面呈红色信号。制备成的大鼠肝脏去细胞支架在扫描电镜下显示细胞外基质保留,无细胞核及细胞质成分。结论：成功分离出了肝细胞和肝窦内皮细胞并成功制备了肝去细胞支架。     

一种改良的去细胞皮瓣制备方法

目的：探索一种简易的去细胞皮瓣制备方法,并对制备完成的去细胞皮瓣的生物学特征进行分析。方法：取成年大鼠下腹壁处皮瓣去血后,使用磁力搅拌器进行辅助震荡法去细胞。对所获支架通过DNA定量分析、SDS残留量检测、扫描电镜等检测获取其生物学特征数据。再取皮下包埋于成年SD大鼠背部的去细胞皮瓣标本,统计新生血管数目检测其生物相容性,检测外周血中调节性T淋巴细胞的比例。结果：实验组DNA含量较对照组下降超过95%（P ＜0.05）;DAPI染色未见明显细胞核,扫描电镜及HE染色观察到实验组保留大量细胞外基质;SDS残留远低于生物安全水平;血管造影显示实验组血管分支完整、清晰,新生血管数明显多于对照组（P＜0.05）。动物实验结果示血管再生数目多且调节性T淋巴细胞比例增高（P＜0.05）。结论：提供了一个制备具有良好生物相容性且支架结构完整的去细胞皮瓣的方法,去细胞皮瓣具有低排斥和较好生物相容性的特点。     

具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架的制备

目的制备具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架材料,为构建组织工程血管奠定基础。方法用含有脱氧胆酸钠、SDS、EDTA的低渗液和等渗液以及核酸酶对猪的胸主动脉进行脱细胞处理．使用HE、Movat五色法、DAPI染色及电镜观察处理结果。以MTT法分析脱细胞溶液的细胞毒性,通过种植内皮和平滑肌细胞,分析支架的细胞相容性。结果上述方法使用的脱细胞溶液细胞毒性低;经该法处理后,血管的细胞成分完全去除,胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白等主要基质成分充分保留,组织结构完整,内皮细胞和平滑肌细胞可以在上面黏附生长,形成完整的细胞层。结论利用脱氧胆酸钠、SDS、EDTA和核酸酶联合消化的方法．可制备出基质成分充分保留、细胞相容性优良的脱细胞血管支架．适于构建组织工程血管。     

Decellularized aorta of fetal pigs as a potential scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft

Background For cardiovascular tissue engineering, acellularized biomaterials from pig have been widely investigated. Our purpose was to study mechanical properties and biocompatibility of decellularized aorta of fetal pigs （DAFP） to determine its potential as scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft. Methods Descending aorta of fetal pigs was removed cells using trypsin, ribonuclease and desoxyribonuclease. Mechanical properties of DAFP were evaluated by tensile stress-strain and burst pressure analysis. Assessment of cell adhesion and compatibility was conducted by seeding porcine aortic endothelial cells. To evaluate biocompatibility in vivo DAFP was implanted subcutaneously into adult male Sprague Dawley rats for 2, 4 and 8 weeks. Results Histochemistry and scanning electron microscopy examination of DAFP revealed well-preserved extracellular matrix proteins and porous three-dimensional structures. Compared with fresh aorta, DAFP had similar ultimate tensile strength, axial compliance and burst pressure. Cell culture studies in vitro showed that porcine aortic endothelial cells adhered and proliferated on the surfaces of DAFP with excellent cell viability. Subdermal implantation demonstrated that the DAFP did not show almost any immunological reaction and exhibited minimal calcification during the whole follow-up period. Conclusion The DAFP has the potential to serve as scaffolds for small diameter tissue engineered vascular graft.     

骨膜去细胞生物支架在骨缺损小鼠体内的血管化机制

目的：观察骨膜去细胞生物支架对小鼠股骨骨缺损的修复作用及支架内血管形成过程,探讨其血管形成的可能机制。方法：采用物理冻融、化学和生物酶试剂等序贯处理获得骨膜去细胞生物支架。体外实验方面,通过细胞划痕试验观察骨膜去细胞支架浸提液对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移的影响以评价骨膜去细胞支架中是否存在促血管化的生物因子,同时通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测支架中的血管内皮生长因子（VEGF）。在体动物实验方面,通过建立小鼠股骨骨缺损模型评价骨膜去细胞生物支架通过促血管化诱导骨修复的可能性。在小鼠股骨远端制备0.5 mm直径的单皮质骨缺损后,于骨缺损处植入骨膜去细胞支架后逐层缝合切口,对照组小鼠骨缺损处不放置材料。分别在术后第7天、第14天、第21天和第28天,取材、固定、脱钙、包埋和切片,通过HE染色评价骨缺损区骨修复情况,通过免疫荧光染色观察血管性血友病因子（vWF）以评价缺损区血管化情况。结果：体外细胞实验表明,去细胞骨膜支架浸提液对HUVEC的增殖没有明显的抑制作用;细胞划痕实验结果显示,与对照组相比,支架浸提液组细胞的迁移面积更大,去细胞骨膜支架浸提液能够有效促进HUVEC的迁移并且在支架浸提液中检测到VEGF,其浓度为210 pg/mL。动物实验方面,HE染色证明去细胞骨膜支架可以促进骨缺损区域血管的生长和新骨形成,免疫荧光染色进一步证明去细胞骨膜支架对骨缺损的修复活动伴随血管化的发生过程,且去细胞骨膜支架中血管的密度随时间延长呈现先增多后减小的趋势。结论：去细胞骨膜支架可以血管化,并且促进骨缺损的愈合。VEGF可能是其血管形成过程中的关键因素。