人肺腺癌诺维本耐药细胞株的耐药机制

 研究人肺腺癌诺维本耐药细胞系Anip973/NVB的耐药机制。 方法 免疫组织化学法检测人肺腺癌诺维本耐药细胞系的P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白(MRP)的表达,逆转录 聚合酶链反应（RT-PCR）法检测MDR1基因以及MRP3基因的转录。 结果 Anip973/NVB中MRP呈强阳性表达,而Anip973未见表达。Anip973/NVB细胞中MRP3的mRNA转录增加,未检测到MDR1的mRNA产物（Ｐ<0.05）。 结论 MRP3在人肺腺癌诺维本耐药细胞中高表达,说明诺维本的耐药机制可能与MRP3的表达相关。     

苯丁酸调控对顺铂抑制人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株增殖与侵袭协同作用研究

目的肺癌已成为威胁人类生存的重要杀手,且随着环境恶化,其发病率和死亡率有逐年升高趋势。本研究分析4-苯丁酸对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖和侵袭影响,为临床治疗提供参考。方法体外培养人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP至生长状态良好,分析顺铂及4-苯丁酸联合顺铂对A549/DDP细胞株增殖作用,酶联免疫吸附测定法分析细胞凋亡相关蛋白表达变化,Transwell实验分析细胞侵袭力变化,蛋白质印迹法和免疫细胞化学分析细胞中JAK/STAT信号通路蛋白表达变化。结果随着时间延长,各组对A549/DDP细胞株增殖抑制率呈上升趋势,且高剂量4-苯丁酸联合顺铂组对A549/DDP细胞株增殖抑制率较高,差异有统计学意义,F药物=110.342,P<0.001;F时间=34.527,P<0.001;F药物×时间=58.321,P<0.001。与对照组相比,低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞凋亡蛋白Bcl-2水平降低,Bax、Caspase-3和Caspase-6水平升高,均P<0.001。对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞侵袭力分别为423.3±35.6、389.3±24.7、375.6±35.2和285.6±23.9,F=44.458,P<0.001;蛋白质印迹法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为1.32±0.26、1.01±0.24、0.90±0.12和0.74±0.13,F=18.633,P<0.001;STAT2水平分别为0.78±0.13、0.70±0.15、0.62±0.09和0.54±0.09,F=18.996,P<0.001;STAT3水平分别为1.01±0.23、0.89±0.14、0.74±0.10和0.40±0.10,F=19.687,P<0.001。免疫细胞化学法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为0.85±0.14、0.78±0.11、0.62±0.17和0.52±0.09,F=21.854,P<0.001;STAT2水平分别为0.85±0.20、0.77±0.14、0.69±0.08和0.52±0.13,F=17.852,P<0.001;STAT3水平分别为0.63±0.14、0.57±0.11、0.50±0.09和0.42±0.08,F=29.754,P<0.001。结论4-苯丁酸调控对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖、侵袭有明显抑制作用,且其作用可能与影响JAK/STAT信号通路蛋白表达有关。     

核酶对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转

目的 探讨针对多药耐药基因（ｍｄｒｌ）的核酶对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法以ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ ８８０位点为靶位点,通过脂质介导,将抗ｍｄｒｌ核酶表达质粒（ｐＨ β Ａｐｒ－ｌ ｎｅｏ／ｍｄｒｌ－Ｒｂ）导入肺腺癌耐药细胞株Ａ５４９／Ｒ。分别采用ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及ＭＴＴ方法,观察细胞的ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ、Ｐ糖蛋白（Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｐｇｐ）表达和对阿霉素敏     

双氢青蒿素逆转人肺腺癌细胞多药耐药作用研究

目的观察双氢青蒿素和顺铂在体外对A549及A549/CDDP细胞的作用,分析双氢青蒿素抗肺癌和逆转耐药效果。方法采用细胞计数法绘制亲代A549细胞和A549/CDDP细胞生长曲线,细胞增殖及增殖抑制实验采用MTT检测法:A549/CDDP细胞分为顺铂单药作用组,联合作用组(100nM双氢青蒿素加顺铂,320nM双氢青蒿素加顺铂),序贯治疗组(100nM双氢青蒿素预处理),用MTT检测法分析计算IC50值进行比较。结果顺铂对人肺腺癌A549细胞和A549/CDDP细胞IC50值分别为0.270μg/ml和5.703μg/ml,耐药倍数为21.12。对A549/CDDP细胞,联合治疗100nM双氢青蒿素组顺铂IC50值为2.225μg/ml(逆转倍数2.56),320nM双氢青蒿素组顺铂IC50值0.464μg/ml(逆转倍数12.29)。对A549/CDDP细胞,序贯治疗组顺铂IC50为2.523μg/ml(逆转倍数2.26)。结论联合用药和序贯治疗均可逆转A549/CDDP细胞对顺铂的耐药。     

人参皂苷CK对人肺腺癌A549细胞株的增殖抑制作用及其机制

目的:探讨人参皂苷CK对人肺腺癌A549细胞增殖的影响及其作用机制。方法:不同浓度的人参皂苷CK作用于人肺腺癌A549细胞株,MTT比色法测定细胞增殖抑制率;倒置显微镜观察细胞形态学变化;流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡;ELISA法检测细胞内源性VEGF含量的变化。结果:人参皂苷CK对A549细胞增殖有抑制作用,其抑制作用呈浓度和时间依赖关系;倒置显微镜下可观察到细胞明显的形态学改变;流式细胞仪可检测到实验组细胞出现明显的凋亡峰,且细胞周期被阻滞在G0/G1期;实验组细胞培养液中的VEGF低于对照组(P＜0.05),且随着人参皂苷CK浓度增加和作用时间的延长,VEGF的含量降低(P＜0.05)。结论:人参皂苷CK可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖并诱导其凋亡,并能抑制其内源性分泌VEGF。     

人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其生物学特性研究

目的建立耐紫杉醇的人肺腺癌细胞株模型SPC-A1/Taxol,并初步研究其生物学特性。方法应用浓度递增和短时作用法,从人肺腺癌细胞株SPC-A1中诱导分离出对紫杉醇耐药的细胞亚株(SPC-A1/Taxol)。采用MTT法检测耐药细胞的耐药指数及对抗癌药物的敏感性;光镜和透射电镜观察细胞形态;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布;以免疫细胞化学染色检测多药耐药基因(mdr1)的表达产物P-糖蛋白(P-gp)。结果经MTT法检测,SPC-A1/Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代SPC-A1细胞的759.46倍,对Taxotere、NVB、ADM呈高度耐药状态,对VP-16和HCPT有轻度的耐药,而对DDP、GEM以及中药榄香烯乳无交叉耐药现象。耐药细胞的群体倍增时间是亲代细胞的1.32倍;细胞形态未见明显改变;G0 G1细胞比例减少,S期细胞增多。SPC-A1细胞无P-gp表达,SPC-A1/Taxol则高表达P-gp。结论SPC-A1/Taxol肺腺癌细胞株是一个明确的多药耐药模型,具有耐药细胞的基本生物学特性,推测其多药耐药性与P-gp的高表达相关。     

人肺腺癌细胞多药耐药逆转的反义策略

目的：探讨反义策略（反义核酸和Ribozyme)对肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法：分别以mdrl cDNA-9- 6和mdrl mRNA 880位点的GUC为靶位点,通过脂质体介导将相应的反义核酸（ATC CAT CCC GAC CTC）和anti-mdrl mdrl Ribozyme表达质粒DNA（pHβApr-1 neo/mdrl-Rb)导入肺腺癌耐药细胞株A549／R,分别采用RT－PC,流式细胞仪,罗丹明试验及MTT方法观察细胞的mdrl mRNA,Pgp表达,罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性的变化。结果;经反义核酸和anti-mdrl mdrl Ribozyme处理的细胞mdrl mRNA,Pgp明显降低,细胞内罗丹明聚集,对阿霉素的敏感性分析提高20倍和180倍,结论：反义核酸和anti-mdrl mdrl Ribozyme具有强大的逆转肺癌MDR的作用,其作用水平在mRNA或DNA水平,使Pgp的表达受到强烈抑制,显示了良好的应用情景。     

CD147 siRNA对人肺腺癌细胞株A2增殖的影响

目的:研究CD147 siRNA转染对肺腺癌细胞系A2中CD147表达及细胞增殖的影响,探讨CD147 siRNA转染对肺腺癌细胞系的作用。方法:用脂质体LipofectamineTM2000介导CD147 siRNA转染人肺腺癌细胞株A2,用RT-PCR检测CD147 mRNA表达,并用MTT法检测CD147 siRNA转染对A2细胞增殖的影响。结果:转染后的肺腺癌细胞株A2中CD147 mRNA表达水平明显下调,转染了CD147 siRNA的细胞在24、48和72 h的增殖能力较A2分别下降了48.3%、51.8%和53.2%(P均<0.05)。结论:CD147 siRNA转染能有效降低肺腺癌细胞株A2中CD147的表达,且能抑制肿瘤细胞的增殖能力。CD147 RNA干扰有可能成为肺腺癌基因治疗的新途径。     

人肺腺癌多西他赛耐药机制的研究

深入研究肺腺癌对多西他赛(docetaxel,DTX)耐药的分子机制,不仅有助于筛选出可用于临床指导DTX个体化用药的分子靶标,也可为耐药的干预策略研究提供研究方向.笔者课题组采用体外逐步提高DTX浓度的方法诱导建立了稳定传代的人肺腺癌SPC-A1耐DTX细胞系SPC-A1/DTX,并从细胞形态、化疗敏感性、增殖、凋亡、细胞周期、药物转运等方面比较了亲本细胞与耐药细胞间的差异.进一步通过基因芯片及miRNA芯片分析,筛选出耐药细胞中差异表达显著的基因(如ING4)以及miRNA(如miR-200b、miR-100),在体内、外模型中进行功能获得性和(或)缺失性研究,证实ING4表达下调、miR-200b/E2F3及miR-100/Plk-1通路的异常参与了肺腺癌细胞DTX耐药表型的形成.     

奥曲肽逆转人胰腺癌细胞多药耐药机制的初步研究

目的：探讨生长抑素类似物奥曲肽对人胰腺癌细胞BxPC-3多药耐药现象的逆转作用及其机理,为临床应用奥曲肽提高胰腺癌化疗疗效提供实验依据。方法：应用不同浓度的奥曲肽（0-1.6μg/ml）联合化疗药物顺铂、表阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨共同处理稳定表达SSTR2的胰腺癌细胞BxPC-3-SSTR2,CCK-8比色法测定奥曲肽处理前后各化疗药物的IC50值,判断奥曲肽对胰腺癌多药耐药的逆转。Real-timePCR法检测SSTR2基因转染前后及奥曲肽处理前后的胰腺癌细胞中MDR1、MRP2、LRP基因表达。结果：奥曲肽可以显著降低顺铂、表阿霉素、氟尿嘧啶和吉西他滨的IC50值（P〈0.05）,并且这种作用呈剂量依赖性。胰腺癌细胞株BxPC-3在转染SSTR2基因后,细胞中MDR1、MRP2、LRP基因的表达分别下调57%、47%和56%（P〈0.01）;而转染后的胰腺癌细胞经过1.6μg/ml奥曲肽作用48h后,其所表达的MDR1、MRP2、LRP基因出现进一步的下调,分别下降88%、73%和87%（P〈0.01）。结论：生长抑素类似物奥曲肽可逆转胰腺癌细胞的多药耐药,其机制可能与降低胰腺癌细胞中MDR1、MRP、LRP基因的表达,使胰腺癌细胞内细胞毒性药物浓度增加有关。     

奥曲肽逆转人胰腺癌细胞多药耐药机制的初步研究

目的:探讨生长抑素类似物奥曲肽对人胰腺癌细胞BxPC-3多药耐药现象的逆转作用及其机理,为临床应用奥曲肽提高胰腺癌化疗疗效提供实验依据.方法:应用不同浓度的奥曲肽(0-1.6 μg/ml)联合化疗药物顺铂、表阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨共同处理稳定表达SSTR2的胰腺癌细胞BxPC-3-SSTR2,CCK-8比色法测定奥曲肽处理前后各化疗药物的IC50值,判断奥曲肽对胰腺癌多药耐药的逆转.Real-time PCR法检测SSTR2基因转染前后及奥曲肽处理前后的胰腺癌细胞中MDR1、MRP2、LRP基因表达.结果:奥曲肽可以显著降低顺铂、表阿霉素、氟尿嘧啶和吉西他滨的IC50值(P<0.05),并且这种作用呈剂最依赖性.胰腺癌细胞株BxPC-3在转染SSTR2基因后,细胞中MDR1、MRP2、LRP基因的表达分别下调57%、47%和56%(P<0.01);而转染后的胰腺癌细胞经过1.6 μg/ml奥曲肽作用48h后,其所表达的MDR1、MRP2、LRP基因出现进一步的下调,分别下降88%、73%和87%(P<0.01).结论:生长抑素类似物奥曲肽可逆转胰腺癌细胞的多药耐药,其机制可能与降低胰腺癌细胞中MDR1、MRP、LRP基因的表达,使胰腺癌细胞内细胞毒性药物浓度增加有关.     

双氢青蒿素抗人肺腺癌A549细胞生长的实验研究

背景与目的　研究发现,青蒿素类药物具有抗肿瘤活性。双氢青蒿素是青蒿素类药物中活性较强的衍生物。本研究的目的是观察双氢青蒿素对肺腺癌A549细胞生长的影响,以便为肺癌治疗提供实验依据。方法　双氢青蒿素对体外培养肺腺癌A549 细胞的生长抑制作用采用MTT检测法,用细胞计数法绘制细胞生长曲线,计算对数生长期群体倍增时间,用流式细胞术检测细胞DNA含量,同时分析药物对细胞周期的影响。体内实验采用裸鼠移植瘤模型进行实验。结果　双氢青蒿素有较强的抑瘤效应,半数抑瘤浓度为0.23μmol/l。人肺腺癌A549细胞对数生长期群体倍增时间在对照组为21. 3 h,在双氢青蒿素作用组为38.5 h,两组比较有显著性差异(P<0.01)。流式细胞仪显示双氢青蒿素作用后G0 +G1 期细胞数增加。移植瘤体内试验显示双氢青蒿素的抑瘤率为54.3%。结论　双氢青蒿素对人肺腺癌A549 细胞在体内外均有生长抑制作用,体外作用与G0+G1 期阻滞有关。     

Regulation of cell proliferation by beta-adrenergic receptors in a human lung adenocarcinoma cell line

We have recently reported that the tobacco-related nitrosamines N-nitrosodiethylamine (DEN) and 4-(methyl-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) stimulate cell proliferation in cell lines derived from human neuroendocrine carcinoma and adenocarcinoma (comprised of Clara cells) of the lung. In the neuroendocrine cell line, this effect was inhibited by antagonists of nicotinic cholinergic receptors which regulate the secretion of peptide hormones and cell proliferation of pulmonary neuroendocrine cells. No such inhibition was observed in the adenocarcinoma line. Clara cells reportedly do not have acetylcholine receptors and secretion of this cell type is regulated by beta-adrenergic receptors instead. In this experiment, we test the hypothesis that the latter types of receptors are involved in the regulation of cell growth of normal and nitrosamine-stimulated adenocarcinoma cells with features of Clara cells. Our data demonstrate a pronounced stimulation of cell growth by the beta-adrenergic agonist isoproterenol, DEN and NNK, as well as a dose-dependent inhibition of such growth-stimulating effects by the beta-adrenergic antagonist propranolol. These findings suggest an important role of beta-adrenergic receptors in the regulation of cell proliferation in lung tumors comprised of this cell type.     

吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ耐药机理的实验研究

目的　观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药性的效果并探讨其与阻断ＮＦ κＢ信号传导通路的相关性。方法　采用ＭＴＴ法检测单用吴茱萸碱、顺铂（ＤＤＰ）以及两药联用在不同时间对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的增殖影响,计算ＩＣ５０及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。ＲＴ ＰＣＲ检测各组ＭＤＲ１、ＮＦ κＢ、Ｂｃｌ-２、ＭＭＰ-２和ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞的ｐＩκＢ-α、pＩＫＫα蛋白表达水平。结果　吴茱萸碱０.１２５ｍｇ／Ｌ、０.２５ｍｇ／Ｌ针对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药逆转倍数分别为３.６６８和１1.４８。ＲＴ ＰＣＲ显示在吴茱萸碱作用下检测基因的ｍＲＮＡ表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与ＤＤＰ联用时,可明显提高Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加（Ｐ＜０.０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法结果提示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ｐＩκＢ-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,ｐＩＫＫα表达则无显著变化。结论　吴茱萸碱可以通过抑制ＩκＢ-α的磷酸化阻断ＮＦ-κＢ信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对ＤＤＰ的敏感性。     

拓扑替康联合放射线对人肺腺癌细胞的作用

目的:探讨拓扑替康(TPT)对人肺腺癌细胞的放射增敏作用及机制。方法: 用克隆形成试验检测TPT对人肺腺癌细胞放射效应的影响;用流式细胞技术检测TPT联合放射线作用后人肺腺癌细胞的周期分布。结果:按照多靶单击模型拟合单纯照射组及加药照射组的细胞放射存活曲线,两组的D0、Dq 及N 值分别为1. 605、1 .734 和2 .946;1 .340、0. 587 和1.550。放射增敏比(SERD0)为1 .2。流式细胞仪分析显示,单纯照射组的S期细胞比例较空白对照组明显增高,加药照射组细胞S期堆积被消除。结论:TPT对人肺腺癌细胞具有放射增敏作用。其机制与TPT抑制人肺腺癌细胞放射损伤的修复并杀伤对放射线不敏感的S期细胞有关。     

SOCS3基因在人肺腺癌细胞株A549中的表达及其对细胞增殖的影响

目的 探讨SOCS3基因在人肺腺癌细胞株A549中的表达及其对细胞增殖的影响。方法 以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至人肺腺癌细胞株A549，利用G418筛选获得阳性克隆；应用RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3表达情况；采用四甲基偶氮唑兰(MTT)显色法检测基因转染前后细胞生长情况；应用流式细胞仪进行细胞周期分析。结果 RT-PCR和免疫细胞化学法证实转染前A549细胞中无SOCS3基因表达，转染后A549细胞中SOCS3基因呈稳定表达。MTT检测显示转染pEFSOCS3的A549细胞生长明显受到抑制，抑制率为41．07％。流式细胞仪检测结果显示转染pEFSOCS3的A549细胞Go／G，期细胞比例显著增高，S、G2／M期细胞比例显著降低。结论 SOCS3蛋白可能通过负性调控细胞内信号通路抑制肺癌细胞增殖。     

N-乙酰半胱氨酸对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转及其与多药耐药蛋白表达的关系

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)时人肺腺癌细胞A549/DDP耐顺铂的逆转作用,探讨其与多药耐药蛋白表达的关系.方法:以MTT法检测不同浓度NAC处理A549/DDP细胞及顺铂联合对A549/DDP细胞的细胞毒性作用,采用RT-PCR检测NAC作用前后A549/DDP细胞MRP mRNA的表达水平.结果:NAC在10、20及50μg/L浓度时其可以增加A549/DDP对顺铂的敏感性,而在NAC浓度为0.1和1μg/L时未见明显的药物逆转作用.NAC在10、20和50 μg/L时其作用后的A549/DDP细胞中MRPmRNA的表达水平低于作用前.结论:NAC可以逆转A549/DDP耐药,由于体外实验中缺乏可能让NAC转为谷胱甘肽(GSH)的微环境,其在另一方面可以通过下调MRP1 mRNA的表达,从而导致细胞对DDP的敏感性增加.