人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-αm RNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-αm RNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-αm RNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-αm RNA的转录从而促进TNF-αm RNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

肠三叶因子启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

目的:克隆肠三叶因子(ITF)启动子序列,构建ITF启动子荧光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:运用PCR方法从人全血基因组DNA中获得目的基因;双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建不同长度的ITF启动子报告基因载体(-100--1 826bp);将重组质粒转染至HEK293细胞和LS174细胞48h后,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果:PCR扩增出不同长度的ITF启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染HEK293细胞和LS174细胞后检测启动子活性,100和200bp启动子活性较低,而300至1 826bp启动子活性较强。结论:成功构建了ITF启动子报告基因载体,具有活性的启动子最小长度为300bp。     

低氧调控p53RFP基因启动子活性的初步研究

目的 观察低氧对p53RFP基因表达及启动子活性的影响，探索低氧反应元件(HRE)是否参与了低氧对p53RFP基因启动子活性的调控。方法 将HEK293细胞置于低氧条件下培养，实时定量PCR及Western blot检测p53RFP mRNA及蛋白表达水平；通过定点突变技术构建HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体并转染HEK293细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养，双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。结果 低氧处理不同时间点p53RFP mRNA表达水平均显著增加，差异有统计学意义(F=96.493,P<0.001);低氧组p53RFP及HIF-1α蛋白表达量均呈时间依赖性递增。成功构建了HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因检测显示，与常氧组相比，低氧条件下野生型p53RFP基因启动子活性增加(t=-19.504,P<0.001),HRE单突变或双突变后启动子活性均较野生型降低(F=160.891,P<0.001)。结论 低氧可诱导p53RFP基因表达上调；成功构建了HRE突变型p53RFP双荧光素酶报告基因载...     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响。方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到ADAM33基因启动子区1 953 bp片段。通过双酶切、连接、转化等步骤将该片段克隆至pGL3-Basic载体构建ADAM33启动子重组质粒,并将其转染至人HEK293T、BEAS-2B细胞中;利用双荧光素酶报告基因技术检测HEK293T、BEAS-2B细胞中所构建的质粒启动子活性。将HEK293T、BEAS-2B细胞分为pcDNA-GATA3组和pcDNA3.1对照组,分别转染GATA3过表达质粒和空白对照质粒,用双荧光素酶报告基因技术检测荧光素酶活性;用实时荧光定量PCR检测BEAS-2B细胞中ADAM33 mRNA相对表达水平。结果:通过PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建含ADAM33启动子片段的重组质粒;重组质粒的ADAM33启动子活性较pGL3-Basic对照组...     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

TNF-α regulates netrin-1 expression through enhancing promoter activity

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究.方法 采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测TNF-α对netrin-1表达的影响.用PCR反应扩增netrin-1启动子序列,克隆至pGL3荧光素酶报告基因载体,转染HEK 293A细胞,通过检测荧光素酶活性观察TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控.结果 TNF-α(20 ng/ml)能上调netrin-1的表达.成功构建pGL3 netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,并证实构建的报告基因载体启动子具有活性;发现TNF-α可使netrin-1启动子活性增加(P＜0.05),并以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性.结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin 1的表达.     

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。     

Klotho基因启动子区域定位及活性分析

目的构建含不同长度klotho基因启动子片段的报告基因载体,研究其在不同细胞系中的转录活性。方法以人全血基因组DNA为模板,克隆长短不同的klotho基因启动子片段,命名为klothoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用Lipofectamine 2000将重组质粒分别和pRL-TK共转染HEK293和HeLa细胞,分析不同长度的klotho基因启动子片段在细胞内的转录活性。结果双酶切和测序鉴定均显示表达载体构建成功;klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6;双荧光素酶活性检测显示klothoⅢ在2种细胞中的转录活性明显高于klothoⅠ、Ⅱ(P<0.05),而klothoⅣ的转录活性在HEK293细胞中能维持高水平,在HeLa细胞中显著下降(P<0.01)。结论 klotho基因启动子在不同细胞中的转录活性不同,-973～-504区域可能是导致HeLa细胞中klothoⅣ转录活性下降的原因。     

稳定沉默TRB3细胞模型及TRB3启动子报告基因的建立

构建人TRB3基因的shRNA真核表达载体和稳定沉默TRB3的人结肠癌细胞系HCT-8,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因,为以TRB3为靶点的药物研究提供有效的筛选平台。针对TRB3的mRNA设计寡核苷酸序列,构建TRB3-shRNA表达载体和control-shRNA阴性对照载体,宿主菌扩增,并测序鉴定。测序正确的重组质粒转染HCT-8细胞,以潮霉素筛选,分别建立稳定表达TRB3-shRNA和control-shRNA的HCT-8细胞系。通过细胞划痕-修复实验检测细胞的迁移能力。同时,通过克隆、酶切、连接、转化和扩增,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因pTRB3-Luc,转染HEK293ET细胞并给予衣霉素刺激,检测荧光素酶报告基因的活性。经测序证实,TRB3-shRNA真核表达载体构建成功,插入的DNA片段与设计序列完全一致。在建立的稳定表达TRB3-shRNA的HCT-8细胞中,TRB3的mRNA和蛋白表达水平都显著下降,细胞的迁移能力显著降低。同时,TRB3启动子区荧光素酶报告基因pTRB3-Luc构建成功,并在衣霉素诱导下呈现剂量依赖性的活性增强。TRB3-shRNA重组质粒、稳定沉默TRB3的HCT-8细胞系和TRB3启动子报告基因的建立为进一步研究TRB3在肿瘤发生发展过程中的作用以及TRB3抑制剂的筛选提供了有力的工具。     

表皮生长因子受体对苯并芘诱导的人支气管上皮细胞SIRT1活化的影响

目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）在调控苯并芘（B[a]P）诱导人支气管上皮BEAS-2B细胞沉默信息调节因子1（SIRT1）活化中的作用,阐明EGFR/SIRT1信号转导通路与肺癌发生发展的关系。方法：MOTIF Search^TM分析软件预测SIRT1启动子序列上转录DNA结合位点。培养BEAS-2B细胞,设不加苯并芘的细胞为对照组,苯并芘组细胞暴露于苯并茈（8 μmol·L^-1）不同时间（6、12、24和48h）,RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测各组细胞中EGFR mRNA和蛋白表达水平。将SIRT1启动子荧光素酶报告载体转染入BEAS-2B细胞中,采用人表皮细胞生长因子（hEGF）和酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein处理细胞24h,倒置显微镜观察各组BEAS-2B细胞形态表现,荧光素酶报告基因技术检测SIRT1荧光素酶活性。收集相关肺组织临床标本,免疫组织化学法检测肺组织中EGFR蛋白表达水平。结果：SIRT1启动子序列上含有表皮细胞生长因子（EGF）、铁氧还蛋白（2Fe-2S）和血管性血友病因子（vWF）3个转录因子的DNA结合位点。与对照组比较,苯并芘组细胞中EGFR mRNA表达水平升高（P < 0.05）,且在12h达到峰值,同时EGFR蛋白表达水平均不同程度升高（P < 0.05）。与对照组比较,hEGF组和苯并芘组BEAS-2B中细胞SIRT1荧光素酶活性明显增加（P < 0.05）,hEGF联合苯并芘组BEAS-2B细胞中SIRT1荧光素酶活性增加更为明显（P < 0.001）;Genistein大于30 μmol·L^-1时,细胞排列逐渐稀疏,形态改变明显;Genistein（30 μmol·L^-1）能够抑制苯并芘诱导的SIRT1荧光素酶活性的增加,与苯并芘组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组织化学法,肺癌组织中EGFR蛋白表达水平明显高于正常肺组织（P < 0.001）。结论：苯并芘暴露下,EGFR能够促进SIRT1的表达,从而诱导肺慢性炎症反应,EGFR/SIRT1信号转导通路在肺癌的发生发展过程中发挥一定的作用。     

糖皮质激素诱导A549细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用

目的 探讨糖皮质激素诱导11β-羟基类固醇脱氢酶1型表达,其选择性启动子的使用情况,为进一步研究糖皮质激素诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础.方法 糖皮质激素皮质醇（100 nM）和地塞米松（100 nM）预先处理A549细胞,通过半定量-RT-PCR和荧光报告基因检测方法,检测A549细胞中HSD11B1 mRNA表达水平和报告基因蛋白表达水平.结果 半定量-RT-PCR结果显示A549细胞中HSD11B1mRNA表达显著增加经由P1和P2两个启动子,但HSD11B1 mRNA表达主要来自于P2;荧光报告基因表达结果显示A549细胞中糖皮质激素诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加,然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化.结论 糖皮质激素诱导A549细胞HSD11B1表达经由选择性启动子P2.     

丙戊酸钠对哮喘相关基因ORMDL3的作用及其机制研究

目的: 探讨心脏死亡供体（donation after cardiac death,DCD）原位肝移植术后胆道并发症的发生因素、诊断要点和治疗方法。方法: 对2015年1月—2016年8月于南京医科大学第一附属医院肝移植中心实施的87例DCD供肝肝移植患者临床资料进行回顾性分析。87例中29例行经典原位肝移植,58例行改良背驮式肝移植,胆管重建方式均为胆总管端端吻合,无1例放置T管。结果: 87例肝移植患者中9例通过胆道造影确诊为肝移植术后胆道并发症, 8例治愈, 1例好转, 无死亡。胆道并发症发生率10.1%(9/87)。结论: DCD供体原位肝移植术后胆道并发症的发生与供肝缺血时间、DCD供肝质量、胆管吻合技术及供肝修剪技术等因素有关,术后胆道造影有助于及时诊断胆道并发症。介入技术是胆道并发症的主要治疗手段。     

β-防御素-2荧光素酶报告基因载体及克罗恩突变体的构建

目的：构建人β-防御素-2（hBD-2）荧光素酶报告基因质粒及其克罗恩病（Crohn’s,CD）相关突变体,并检测其在人胚胎肾T细胞（HEK-293T）中的活化．方法：通过基因重组构建包含hBD-2启动子序列的报告基因质粒hBD-2—780-luc,再通过定点突变技术在启动子区（-233位点）引入变异点（G变为C）,构建突变体hBD-2-mut-luc;经酶切及测序验证后,将报告基因质粒和野生型NOD2／CARD15蛋白真核表达载体共转染到HEK一293T中,TNF—α刺激后测定双荧光素酶的表达．结果：酶切和测序证实,构建了重组体hBD-2-780-luc及其突变体hBD-2-mut—luc,两者均能表达荧光素酶活性,且明显高于空载体．结论：hBD-2报告基因质粒hBD-2-780-luc及其CD相关突变体hBD-2-mut—luc构建成功,并在细胞内活化表达荧光素酶．     

硝苯地平对人孕烷X受体介导的CYP286和CYP2C9的转录调节作用

目的 建立hPxR介导的CYP286、CYP2C9药物诱导剂的体外筛选体系,分析硝苯地平诱导CYP286、CYP2C9的分子机制.方法 利用双荧光素酶报告基因系统,将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP286和2C9启动子序列插入报告基因上游,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,以10μM利福平为阳性对照,用1、5或10μM硝苯地平处理48h后裂解细胞进行双荧光素酶活性检测;或用10μM硝苯地平分别处理细胞12、24和48h后进行双荧光素酶活性检测.结果 硝苯地平激活hPXR的起始浓度为1～5μm,在5μm浓度下,硝苯地平诱导CYP286和2C9表达增加3.93和3.59倍,与DMSO溶媒组差异存在显著性(P<0.001),在10μm硝苯地平作用下,CYP286和2C9表达分别增加6.23和5.24倍,与溶媒对照组和5IXm浓度组差异都存在显著性(P<0.001).10μm硝苯地平处理12 h后即能显著地诱导CYP286和CYP2C9表达增强,但其诱导倍数与24和48 h组差异存在显著性(P<0.001).结论 该研究成功构建了hPXR介导的CYP286和CYP2C9药物诱导剂的体外筛选体系;硝苯地平通过激活hPXR介导了CYP286和2C9的表达上调,并表现出明确的剂量-效应关系.     

HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析

目的：分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF、50基因上游启动子区序列，评价其在293细胞中启动活性。方法：以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV-8 ORE50启动子区序列，克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点，分别构建含正反双向ORE50启动子重组报告质粒，并分别转染293细胞，作Lu-ciferase活性检测，计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果：①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp)，含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列；②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比，其RLU增加了26．3倍；③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4．1倍。结论：HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性；TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。