大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源甲状腺髓样癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的：应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）噬菌体单链抗体库。方法：提取ＭＴＣ病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因VH和VL基因片断,以它们为模板分别扩增VH-Linker和VL-Linker,再用剪切重叠延伸ＰＣＲ技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段（single chain fragment variable,scFv）后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果：MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5％（21/24）。结论：成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的：用黑素瘤（MM）细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库，获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体（scFv）．方法：用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定，得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定．结果：从80个随机挑选的克隆中，筛得1株抗MM细胞的抗体，该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠igG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性．免疫组化染色显示，该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性，对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性．DNA测序结果表明，该抗体VH属于人IgG VH5亚群，VL属于人Vκ亚型．结论：通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体，为MM的靶向治疗研究奠定了基础．     

新式SOE PCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用

目的探讨新式SOEPCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用。方法通过引物设计的改变,将6种人VH基因和11种人VL基因利用两步法直接互相两两连接为人scFv基因,并且与传统的SOE法进行对比。scFv基因用于构建噬菌体单链抗体库。结果新式SOEPCR法成功的将6种人VH基因和11种人VL基因连接成66种不同的人scFv基因,与传统的SOEPCR法相比,效率高且方法简便,经过约130次电转化后,抗体库的总库容为5·58×109。结论成功地改进了传统的SOEPCR方法,高效组装了66种不同的人scFv基因,提高了抗体库的多样性。     

人源性抗地高辛单链抗体（scFv）及diabody的获取

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体（scFv），并构建双价抗体（diabody）．方法：以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选，4轮后挑取集落，用ELISA法鉴定其特异性，并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析，选取活性好的抗体基因进行改造，构建diabody．结果：在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象，获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体，经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因，     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFV-M97基因克隆及分泌性表达

目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体.方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×109pfu/ml单链抗体库.对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体.结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732 bp.其中VH 351 bp,编码117个氨基酸;VL 336 bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gly4Ser)3相连.阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20 h,培养液上清中有2 μg/ml可溶性单链抗体.免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力.结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础.     

Modification and identification of a vector for making a large phage antibody library

Background The large phage antibody library is used to obtain high-affinity human antibody, and the Loxp/cre site-specific recombination system is a potential method for constructing a large phage antibody library. In the present study, a phage antibody library vector pDF was reconstructed to construct diabody more quickly and conveniently without injury to homologous recombination and the expression function of the vector and thus to integrate construction of the large phage antibody library with the preparation of diabodies. Methods scFv was obtained by overlap polymerase chain reaction (PCR) amplification with the newly designed VL and VH extension primers. loxp511 was flanked by VL and VH and the endonuclease ACC Ⅲ encoding sequences were introduced on both sides of loxp511. scFv was cloned into the vector pDF to obtain the vector pDscFv. The vector expression function was identified and the feasibility of diabody preparation was evaluated. A large phage antibody library was constructed in pDscFv. Several antigens were used to screen the antibody library and the quality of the antibody library was evaluated. Results The phage antibody library expression vector pDscFv was successfully constructed and confirmed to express functional scFv. The large phage antibody library constructed using this vector was of high diversity. Screening of the library on 6 antigens confirmed the generation of specific antibodies to these antigens. Two antibodies were subjected to enzymatic digestion and were prepared into diabody with functional expression. Conclusions The reconstructed vector pDscFv retains its recombination capability and expression function and can be used to construct large phage antibody libraries. It can be used as a convenient and quick method for preparing diabodies after simple enzymatic digestion, which facilitates clinical trials and application of antibody therapy.     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography

Objective To isolate human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by a new method of panning phage antibody library based on immobilized metal affinity chromatography （1MAC）. Methods Phage antibody library was allowed to mix with hex-His tagged expressed HEV specific antigen, NE2, in solution for adequate binding before affinity resin for hex-His was added. The non-specific phage antibodies were removed by extensive washing and the specific bound phage antibodies could then be eluted to infect TG1 or repeat the binding process for subsequent rounds of purification. The specificity of the selected human antibodies were tested by antigen competitive ELISA, human sera blocking ELISA, scFv expression, and sequence analysis. Results His-NE2 specific recombinant phages were successfully enriched after panning procedure. Two individual phage clones, 126 and 138, showed 50% inhibition in NE2 antigen competition ELISA and obvious blocking effect by HEV positive serum in blocking ELISA. Soluble scFv of 126, 138 bound to NE2 specifically. Conclusion Two specific human phage antibodies against hepatitis E virus （HEV） from phage display library were isolated by immobilized metal affinity chromatography. The immobilized metal affinity chromatography applied to phage antibody selection was a helpful supplement to the selection in solution.     

抗人宫颈癌单链抗体的表达、结构预测和功能分析

目的扩增、表达抗人宫颈癌单链抗体（ScFv）基因;对ScFv蛋白进行活性鉴定、二级结构、三维结构预测和理化性质分析。方法采用基因重组技术构建抗人宫颈癌ScFv基因,进行TG1和HB2151两个原核体系的表达;SDS-PAGE、Western blotting、竞争抑制实验、免疫组化反应检测ScFv;用Antheprot 4．3软件、Swiss-model、3dpssm进行蛋白理化性质分析和立体结构模拟。结果抗人宫颈癌可溶性ScFv大小为32000左右,与预计蛋白相对分子质量相符;可溶性和展示性ScFv均可与人宫颈癌细胞株细胞膜表面抗原结合。免疫组化显示能与宫颈癌组织特异性结合而不与正常宫颈组织和其他肿瘤组织结合。ScFv蛋白等电点预测值为7．215,属于α＋β蛋白;VH和VL区均有多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点。三维结构预测显示linker贴近。使VL和VH形成一个疏水的“口袋”。这一结构有利于抗原的结合。结论经基因工程方法制备的抗人宫颈癌ScFv具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性和特异性。抗人宫颈癌ScFv构建为进一步构建双特异性ScFv和双功能ScFc基因创造了条件;其成功的表达为人宫颈癌的早期诊断和特异性治疗打下了基础。计算机对ScFv蛋白的空间结构的模拟和理化性质的分析为ScFv的进一步政建和抗原、抗体反应的研究提供了宝贵的资料。     

抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定

目的 筛选具有较好结合能力的抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体(scFv),并进行可溶性表达和鉴定.方法 前期实验室构建了抗木瓜凝乳蛋白酶全套鼠源scFv噬菌体抗体文库,对抗体文库进行4轮富集后,采用ELISA筛选抗木瓜凝乳蛋白酶阳性scFv;将ELISA最强阳性克隆pFAB5C-scFv的重组噬粒切除gene 3 singal后进行表达,SDS-PAGE分析、双抗体夹心ELISA分析、鉴定表达产物,并将阳性克隆可变区序列与Gene Bank数据库进行同源性比较.结果 经4轮噬菌体展示富集,筛选到3株亲和力相对较高的阳性克隆;去除gene 3 singal后的重组scFv在宿主菌E.coli XL1-blue中主要以可溶性的形式进行了表达,且对木瓜凝乳蛋白酶有较好的亲和力.基因序列分析表明阳性克隆所包含的重链可变区基因(VH)与小鼠免疫球蛋白γ重链基因同源性达96％,轻链可变区基因(VL)和小鼠免疫球蛋白轻链κ基因同源性达98％.结论 成功筛选出结合能力较好的抗木瓜凝乳蛋白酶scFv并进行了可溶性表达,所克隆的scFv基因符合小鼠抗体序列的特征.