醛固酮对成骨细胞增殖分化及成骨相关基因表达的影响

目的 探讨外源性醛固酮对大鼠原代培养的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因表达的影响及其机制.方法采用酶消化法体外培养大鼠成骨细胞,CCK-8试剂盒和AKP试剂盒分别检测成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性情况,半定量RT-PCR和Western blotting检测成骨细胞骨形成活性相关标志物和上皮钠离子通道(α-ENaC)基因的mRNA和蛋白表达.结果与对照组相比,醛固酮浓度为1×10-2~1μmol/L范围内可以促进成骨细胞增殖,浓度为1×10-3μmol/L和10μmol/L时对成骨细胞增殖无显著影响;但醛固酮在1×10-3~10μmol/L浓度范围内对成骨细胞碱性磷酸酶活性均无明显影响.与对照组相比,醛固酮浓度为1×10-2~1μmol/L时均能上调成骨细胞中成骨细胞骨形成活性相关标志物I型胶原蛋白(Coll-Ia)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和α-ENaC基因的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05).结论醛固酮(1×10-2~1μmol/L)能明显促进成骨细胞增殖并上调成骨细胞骨形成活性相关标志物的表达,且同时上调ENaC基因的表达,提示ENaC可能是醛固酮调节成骨细胞功能的作用靶点之一.     

肼苯哒嗪对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231雌激素受体α去甲基化的影响

目的探讨肼苯哒嗪对雌激素受体（ER）α阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231ERα基因启动子区CpG岛DNA甲基化的影响。方法体外细胞培养,按药物浓度分为4组：分别用0、5、10、20μmol／L的肼苯哒嗪作用ERa阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231细胞96h;按药物作用时间分为4组：分别于0、72、96、120h10μmol／L肼苯哒嗪作用ERn阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231细胞,倒置光学显微镜下观察肼苯哒嗪对细胞生长的影响。各组提取MDA—MB-231细胞总RNA,用RT-PCR及图像分析检测肼苯哒嗪对MDA—MB-231细胞ERamRNA表达的影响;提取MDA—MB-231细胞基因组DNA,纯化、修饰后用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231ERa基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态。结果与对照组比较,5、10、20μmol／L肼苯哒嗪组ER／β-actin光密度积分值比值均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）;72、96、120h10μmol／L肼苯哒嗪组ER／β-actin光密度积分值比值均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。5μmol／L肼苯哒嗪作用120h后ERa基因呈部分去甲基化状态,而经10μmol／L肼苯哒嗪作用120h后的ERα基因呈完全去甲基化状态。结论肼苯哒嗪可以逆转ERα阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231ERα基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态,使沉默基因重新表达。     

雌马酚对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

【目的】研究雌马酚对体外原代培养的成骨细胞增殖和分化作用的影响,以探讨其预防骨质疏松症的作用机制。【方法】用含20%胎牛血清的α-MEM培养新生Wistar大鼠颅骨分离培养的成骨细胞,同时分别给予10-8mol/L-10-6mol/L的雌马酚、雌二醇或二者分别联合雌激素受体拮抗剂ICI182780,MTT法检测细胞增殖能力,对硝基酚磷酸盐法测定成骨细胞碱性磷酸酶活性。【结果】雌马酚与雌二醇均能显著增加体外培养大鼠成骨细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性,且雌激素受体拮抗剂可显著抑制雌马酚和雌二醇的上述效应。【结论】雌马酚可明显促进体外培养大鼠的成骨细胞增殖,并促进前成骨细胞向成骨细胞的分化,推测该促效应可能是通过ER途径来介导的。     

镉对体外培养成骨细胞增殖、凋亡、分化及矿化的影响

目的探讨镉对体外培养成骨细胞（osteoblast,OB）增殖、凋亡、分化及矿化的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养;成骨细胞与不同浓度的Cd2＋作用后,MTT法测定细胞增殖;AO/EB双染法进行凋亡形态学观察;PNPP法检测碱性磷酸酶活性;矿化结节计数和面积测量分析镉对成骨细胞矿化能力的影响。结果各剂量组氯化镉均可抑制成骨细胞增殖,其中2.0μmol/L以上剂量组与对照组相比差异有统计学显著意义（P〈0.01）;16.0μmol/L、32.0μmol/L剂量组OB可见较多凋亡细胞;各时点、各剂量组氯化镉均能抑制ALP活性,尤其是48h以上影响作用更明显（P〈0.01）;0.5μmol/L、1.0μmol/L浓度的氯化镉可明显抑制成骨细胞矿化能力。结论镉离子可以抑制成骨细胞增殖、分化及矿化能力,促进成骨细胞凋亡,对成骨细胞的骨形成能力有明显抑制作用。     

雌马酚对原代培养小鼠骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化的作用

目的：探讨植物雌激素雌马酚（Equol）对体外原代培养小鼠骨髓间充质干细胞（bone marraw -derived mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖及向成骨细胞分化的作用.方法：以无酚红（α-MEM,含活性碳吸附过的10%胎牛血清）培养小鼠BMSCs,同时分别给予雌马酚（10^-8mol/L～10^-6mol/L）、雌马酚（10^-6mol/L）合用雌激素受体（ER）拮抗剂ICI 182 780（10^-7mol/L）;测定[^3H]-甲基胸腺嘧啶掺入率反映细胞增殖情况;测定细胞内碱性磷酸酶活性与钙沉积量反映细胞向成骨细胞分化状态.结果：雌马酚呈剂量依赖性（10^-8mol/L～10^-6mol/L）增加[^3H]-甲基胸腺嘧啶掺入率、细胞内碱性磷酸酶活性与钙沉积量;合用ER拮抗剂ICI182 780（10^-7mol/L）可拮抗雌马酚（10^-6mol/L）刺激BMSCs增殖及向成骨细胞分化的作用.结论：雌马酚可能通过作用于ER而促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化.     

17β-雌二醇和晚期糖化终末产物对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的：探讨不同浓度的17β－雌二醇（17β－estrodiol)对成骨细胞增殖分化的影响及雌激素（estrogen)与晚期糖化终末产物（advanced glycosylation end-product,AGE)共存对成骨细胞的作用。方法：用不同浓度的17β－雌二醇加入大鼠成骨细胞培养体系,不同作用时间,观察对大鼠成骨细胞增殖分化的影响,以及17β－雌二醇与AGE共存时对成骨细胞增殖的影响。结果：17β－雌二醇＞10^-9mol/L主要表现为对大鼠成骨细胞增殖的抑制作用,10^-10和10^-11mol/L则显著促进大鼠成骨细胞的增殖（P＜0．01,P＜0．05）;10^-12-10^-14mol/L的17β－雌二醇培养48h显著抑制成骨细胞增高（P＜0．01）,10^-6-10^-8mol/L 17β-雌二醇存在下培养24,48,72h,均表现出显著抑制成骨细胞的分化,10^-10mol/L 17β－雌二醇与400－1000mg/L AGE共同存在,培养24h则均表现出促增殖作用（P＜0．01）。结论：雌激素在生理浓度对大鼠成骨细胞增殖产生抑制作用,低于生理浓度具有促增殖活性,浓度进一步降低,再次出现抑制作用,且适量浓度的雌激素与高浓度AGE共存时,促进大鼠成骨细胞增殖。     

α-玉米赤霉醇对大鼠成骨细胞IL-6表达及分泌的影响

目的：探讨α-玉米赤霉醇对体外培养的大鼠成骨细胞IL-6表达及分泌的影响。方法体外培养原代SD新生大鼠颅骨成骨细胞,形态学观察、碱性磷酸酶（ALP）染色、I型胶原免疫荧光染色进行成骨细胞鉴定,分别以雌激素及不同浓度的α-玉米赤霉醇作用于成骨细胞,采用RT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测成骨细胞培养上清中IL-6的含量。结果10^-10-10^-5mol/Lα-玉米赤霉醇能够抑制成骨细胞IL-6 mRNA的表达及其蛋白分泌,其中以10-6 mol/L、10-7mol/L的α-玉米赤霉醇作用显著。结论α-玉米赤霉醇能够抑制成骨细胞细胞因子IL-6 mRNA及蛋白的表达,这可能是α-玉米赤霉醇防治绝经后骨质疏松症的机制之一。     

三氧化二砷对乳癌细胞系MDA-MB-468雌激素受体表达的影响

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对人雌激素受体α(ERα)阴性的乳癌细胞株MDA-MB-468进行药物诱导后ERα启动子CPG岛的甲基化状态及蛋白的变化。方法:常规培养MDA-MB-468细胞,采用MTT法检测0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/LAs2O3分别处理24、48和72h后细胞的生长抑制率,甲基化特异性PCR检测1.0、2.0、4.0μmol/LAs2O3处理72h后MDA-MB-468细胞ERα启动子CpG岛的甲基化状态,Westernblot检测1.0、2.0、4.0μmol/LAs2O3处理72h后MDA-MB-468细胞ERα蛋白的表达情况。结果:As2O3可抑制MDA-MB-468细胞增殖,其作用呈时间和剂量依赖性(F浓度=375.603,F时间=474.827,P<0.001)。经1.0、2.0、4.0μmol/LAs2O3处理后的MDA-MB-468细胞启动子CpG岛甲基化水平降低,ERα蛋白重新表达。结论:As2O3明显抑制MDA-MB-468增殖,适当浓度As2O3能诱导ERα去甲基化,使ERα阴性的MDA-MB-468细胞恢复表达ERα。     

P物质对体外培养成骨细胞增殖和活性的影响

目的: 观察P物质(substance P,SP)对体外培养的成骨细胞增殖和活性的影响. 方法: 采用新生大鼠颅盖骨消化法培养成骨细胞,再加入不同浓度的SP,观察细胞生长数量,测定碱性磷酸酶活性及观察细胞周期变化. 结果: 浓度范围从1×10-12～1×10-6 mol/L的SP对成骨细胞的增殖和活性都有促进作用,在浓度为1×10-8 mol/L对成骨细胞增殖和活性的促进作用最强. 结论: SP对成骨细胞增殖和活性有促进作用.     

不同浓度降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞OPG mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠成骨细胞OPG mRNA的表达影响.方法 采用新生大鼠颅盖骨组织块培养成骨细胞,加入不同浓度CGRP干预体外培养成骨细胞,观察成骨细胞增殖和ALP活性,检测OPG mRNA及RANKL mRNA的表达水平.结果 CGRP在浓度为1×10-8mol/L时对成骨细胞增殖的促进作用最强,在1×10-9mol/L时对成骨细胞ALP活性的促进作用最强;CGRP不仅能明显增强OPG mRNA的表达水平(P＜0.05),还能明显抑制RANKL mRNA的表达水平(P＜0.05),以10-8和l0-7浓度时表达最为明显,均呈剂量依赖性;且CGRP可明显上调OPG/RANKL的比值(P＜0.05).结论 CGRP对成骨细胞增殖和活性均有促进作用,可能通过上调成骨细胞OPG/RANKL,最终发挥抑制骨吸收的作用.     

胃癌中雌激素受体-α36与α66 mRNA的表达及其临床病理意义

目的:探讨胃癌中雌激素受体(ER)-α36与ER-α66的mRNA表达及其临床病理意义。方法:采用实时荧光定量RT-PCR方法检测4株胃癌细胞株中ER-α36和ER-α66 mRNA的表达情况;采用半定量RT-PCR方法检测20例人胃腺癌组织中肿块、癌旁组织及正常组织中的ER-α36和ER-α66 mRNA表达情况。结果:ER-α36和ER-α66 mRNA在胃癌细胞株和人体胃癌样本中均有表达。胃癌细胞株中ER-α36表达量高于ER-α66;人体样本中ER-α66在正常组织表达量最高,ER-α36在癌组织中表达量最高,且与患者的年龄、肿瘤的大小、组织学分级以及淋巴结转移相关。结论:ER-α36在胃癌细胞中发挥的作用可能大于ER-α66,ER-α36 mRNA的高表达与胃癌的生物学行为相关。     

UHRF1调控雌激素受体表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

  目的  观察泛素样含PDH和环指域1 (UHRF1)对雌激素受体（ER）α和ERβ表达比率的影响,探讨UHRF1影响甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移的机制。  方法  应用Western blot、实时荧光定量（qRT）-PCR检测正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞BCPAP中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白及mRNA表达。分别用Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA处理BCPAP细胞,qRT-PCR检测各组细胞中ERα和ERβ的mRNA表达;MTT、Transwell分别检测各组细胞增殖、侵袭和迁移。  结果  与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP细胞中UHRF1和ERα蛋白及mRNA表达水平上调（P<0.05）,而ERβ蛋白和mRNA表达水平下调（P<0.05）。与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞中ERα mRNA表达降低（P<0.05）,ERβ mRNA表达升高（P<0.05）;转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移降低（P<0.05）。  结论  UHRF1可上调ERα/ERβ的表达比率,促进甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移。     

葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞PPARγmRNA和CEBPαmRNA表达的影响

目的探讨葛根素防治激素性股骨头缺血性坏死的作用机制。方法大剂量地塞米松诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化,在诱导成脂的同时给予不同浓度的葛根素进行干预。干预6 d后检测细胞内成脂标志物PPARγmRNA和C/EBPαmRNA的表达。结果葛根素干预组PPARγmRNA和C/EBPαmRNA的表达较对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论葛根素防治激素性股骨头缺血坏死的机理不仅是改善股骨头局部的微循环,同时还与其抑制激素诱导下的BMSCs成脂分化有关。     

淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表达的影响

目的:研究淫羊藿苷对成骨细胞增殖、分化以及对核心结合因子α1(Cbfαl)、骨形成蛋白-2(BMP2)、骨形成蛋白-4(BMP4)mRNA表达的影响.方法:以酶序列消化法从新生大鼠颅骨分离、培养成骨细胞,采用碱性磷酸酶染色和钙结节茜素红染色法鉴定细胞.取第3-5代细胞,用CCK-8法检测经0 mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L的淫羊藿苷处理24、48、72 h后成骨细胞的增殖情况.分别用流式细胞技术和对硝基苯酚法检测上述各浓度的淫羊藿苷处理48 h后成骨细胞的增殖指数和碱性磷酸酶(ALP)活性.用real-timePCR法检测10～(-6)mol/L淫羊藿苷处理48 h后成骨细胞Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA表达的改变.结果:10~(-8)～10~(-4)moL/L的淫羊藿苷对成骨细胞均无增殖促进作用,但可促进成骨细胞的ALP活性;10~(-6)mol/L淫羊藿苷可以上调成骨细胞Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA的表达.结论:淫羊藿苷可能是通过上调Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA的表达而促进成骨细胞的分化.     

木犀草素通过逆转OPCML基因甲基化抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖

目的 观察木犀草素对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖以及对OPCML基因表达的影响。方法 体外培养MDA-MB-231细 胞,加入终浓度为0（对照组）以及5、10和20 μmol/L的木犀草素处理孵育24 h或48 h后,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞凋亡;并提取胞内总mRNA和蛋白,以实时定量PCR和Western blot检测OPCML的mRNA及蛋白变化;同时采用甲基化特异性PCR（MSP）检测OPCML启动子区域的甲基化水平,并分析细胞内甲基化酶的活性。结果 MTT结果显示,MDAMB-231细胞经5、10 以及20 μmol/L木犀草素孵育24 h后,随着浓度的递增,细胞活性逐渐降低（P<0.05）。流式细胞术结果也显示,不同浓度木犀草素可不同程度诱导MDA-MB-231细胞凋亡（P<0.05）。此外,木犀草素能以剂量依赖性方式诱导MDAMB-231细胞表达OPCML mRNA和蛋白（P<0.05）。MSP结果也显示,木犀草素可显著下调OPCML启动子的甲基化状态,上调非甲基化OPCML的水平,并能降低细胞内甲基化酶的活性（P<0.05）。结论 木犀草素可抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖,其机制可能与影响OPCML基因的表达以及甲基化水平有关。     

SLE患者雌激素受体α基因多态性与Th1/Th2细胞因子漂移的相关性

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE) 患者雌激素受体α基因多态性与Th1/Th2 细胞因子漂移的关系。方法用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法检测ERα基因1号内含子Xba-Ⅰ和PvuⅡ酶切位点多态性，RT-PCR方法检测外周血单个核细胞（PBMC）IL-10、IL-4、IFN-γ及IL-2mRNA的表达。结果PpXx基因型SLE患者IL-10和IL-4的表达比对照组升高(P＜0.01，P＜0.05)； Ppxx基因型SLE患者IFN-γ、IL-2表达比对照组降低(P＜0.05)；在对照组，4种细胞因子表达差异均无统计学意义。结论不同的ER基因型与不同个体中细胞因子的表达显著相关，ER的不同基因型有可能在一定程度上作为基因背景影响体内细胞因子的表达。     

实时荧光定量PCR法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3mRNA表达的影响

目的：检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3mRNA表达的影响,从分子生物学层面探讨葛根素治疗骨质疏松症的机理。方法：取小鼠胎鼠成骨细胞进行体外培养,以三种浓度1、0.1、0.01μg/mL的葛根素液进行干预,同时设置空白对照组,分别采用碱性磷酸酶（ALP）法检测成骨细胞活性,实时荧光定量PCR法检测葛根素干预液对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3mRNA表达变化的影响。结果：不同浓度葛根素干预液均能够增加成骨细胞内碱性磷酸酶的活性,并且呈浓度依赖性,实时荧光定量PCR结果显示成骨细胞内TGF-β1及Smad 2/3mRNA的表达明显高于阴性对照组（具有统计学差异P〈0.05）。结论：表明葛根素可刺激成骨细胞信号转导蛋白Smad2/3mRNA的表达和刺激TGF-β1的分泌和合成,从而促进骨形成,抑制骨吸收。可能是其有效防治骨质疏松症的疗效机理。