趋化因子受体CCR7介导树突状细胞抗凋亡机制研究

目的研究趋化因子受体CCR7对成熟树突状细胞（DCs）的抗凋亡作用，并对其机制进行探讨。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs，脂多糖诱导成熟。加入CCR7配体CCL21进行刺激，以不加CCL21为对照组，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测磷酸化Akt、Akt蛋白表达，应用Wortmannin抑制PI3K/Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡的变化。结果在CCL21的作用下，DCs细胞凋亡率明显低于对照组，而磷酸化Akt蛋白表达却明显增高（P〈0.05）。DCs经PI3K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论在CCL21作用下，CCR7介导了抗凋亡效应，其对DCs的凋亡调控通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。     

趋化因子受体反义肽核酸抑制小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究

目的　利用小鼠同种异体皮肤移植模型 ,观察趋化因子受体ＣＣＲ5反义肽核酸 (ＰＮＡ)和ＣＸＣＲ3反义ＰＮＡ的抗排斥作用 ,并对其可能的作用机制进行探讨。方法　第一阶段 ,将ＢＡＬＢ/ｃ受鼠随机分成 6组 ,分别给与生理盐水 (ＮＳ ,阴性对照 )、ＣＣＲ5反义寡核苷酸、ＣＸＣＲ3反义寡核苷酸、ＣＣＲ5反义ＰＮＡ、ＣＸＣＲ3反义ＰＮＡ和ＣｓＡ (阳性对照 )。以Ｃ5 7ＢＬ/ 6为供鼠 ,观察各组受鼠移植皮片的存活时间 ,以确定ＰＮＡ的抗排斥效果。第二阶段 ,于移植术后ｄ 7收集ＮＳ、ＣＣＲ5反义ＰＮＡ、ＣＸＣＲ3反义ＰＮＡ和ＣｓＡ治疗组受鼠…     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的 探讨CD86mRNA反义肽核酸（peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法 采用激光共聚焦显微镜研究生物素化PNA的细胞内化；利用流式细胞术，荧光细胞组织化学以及RT-PCR研究CD86反义PNA对CD86分子表达的抑制作用，结果 （1）激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明，培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化PNA。（2）流式细胞术和荧光细胞组织化学证实CD86反义PNA在蛋白质水平上对CD86分子表达有抑制作用。（3）RT-PCR证明反义PNA能够抑制DCCD86mRNA水平。结论 CD86反义PNA能够抑制人树突状细胞CD86mRNA的表达，从而为进一步利用反义PNA阻断第二信号传递，诱导免疫耐受奠定了基础。     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的　探讨 CD86 m RNA反义肽核酸 (peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞 CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法　采用激光共聚焦显微镜研究生物素化 PNA的细胞内化 ;利用流式细胞术、荧光细胞组织化学以及 RT- PCR研究 CD86反义 PNA对 CD86分子表达的抑制作用。结果　 1激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明 ,培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化 PNA。 2流式细胞术和荧光细胞组织化学证实 CD86反义 PNA在蛋白质水平上对 CD86分子表达有抑制作用。 3RT- PCR证明反义 PNA能够抑制 DC CD86m RNA水平。结论　 CD86反义 PNA能够抑制人树突状细胞 CD86 m RNA的表达 ,从而为进一步利用反义 PNA阻断第二信号传递 ,诱导免疫耐受奠定了基础     

甲状腺乳头状癌中趋化因子受体CCR7的表达

趋化因子与趋化因子受体结合后可参与多种生理和病理过程,如细胞生长、发育、分化、凋亡、组织损伤和肿瘤的生长、转移等[1,2].本研究通过检测趋化因子CCR7在甲状腺组织中的表达,探讨CCR7在甲状腺乳头癌的发生、发展和转移中的可能作用.     

趋化因子受体CCR7及其配体的肿瘤生物学作用

趋化因子（chemokine）是一类由不同类型细胞分泌的对免疫细胞具有趋化作用,能使细胞发生趋化运动的低分子量（8～12kd）的细胞因子,在淋巴细胞的定向迁移,造血细胞、免疫细胞的发育和分化,炎症的发生,血管的生成及肿瘤的发生中分别起着不同的作用。趋化因子的功能行使由趋化因子受体（chemokine receptor）介导,趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间定向迁移。     

甲状腺乳头状癌组织趋化因子受体CXCR7和CCR5表达

目的研究趋化因子受体7(CXCR7)和趋化因子受体5(CCR5)在甲状腺乳头状癌(PTC)组织表达及其与PTC不同病理特征的关系。方法应用免疫组化的方法,检测70例PTC、25例甲状腺滤泡腺瘤及11例癌旁(距肿瘤2cm以上)组织中CXCR7及CCR5的表达情况。结果 PTC组织CXCR7和CCR5表达阳性率高于甲状腺滤泡腺瘤及癌旁组织,差异有显著性(χ~2=23.94、26.48,P<0.05);甲状腺滤泡腺瘤和癌旁组织中CXCR7和CCR5表达阳性率比较差异无显著性(P>0.05)。Spearman相关分析显示,PTC组织中CXCR7和CCR5表达呈正相关(r=0.73,P<0.05)。PTC组织中CXCR7和CCR5阳性表达与年龄、性别、TNM分期均无关(P>0.05),仅与淋巴结转移情况有关(χ~2=22.493、21.476,P<0.05)。结论 CXCR7及CCR5可能对PTC的发展及转移起一定的促进作用。     

趋化因子受体CCR7及CXCR4在胃癌中的表达

目的 探讨趋化因子受体CCR7及CXCR4在胃癌中的表达情况以及与胃癌临床指标之间的关系，为胃癌患者预后判断提供分子标志。方法 采用RT-PCR分析CCR7及CXCR4在不同胃癌细胞株和胃癌组织标本中的mRNA水平的表达，免疫组化分析CCR7及CXCR4在胃癌组织标本中蛋白水平的表达，进一步分析CCR7及CXCR4的表达与胃癌临床各项指标之间的关系。结果 ①RT-PCR分析发现CCR7及CXCR4在5株胃癌细胞株中均有表达，其中CCR7在SNU-216中表达最强，CXCR4在SNU-620中表达最强。而CCR7在89．7％（35／39）的胃癌组织中有表达，CXCR4则在100％（39／39）的胃癌组织中均有表达。②免疫组化检测发现，CCR7蛋白胃癌组织标本中的阳性率为20．1％，CXCR4蛋白表达阳性率为41．3％。③统计学分析发现CCR7在分化型胃癌中的表达明显高于在未分化胃癌中的表达（P〈0．01），CXCR4在肠型胃癌中的表达明显高于在弥散型胃癌中的表达（P〈0．01）。且CCR7及CXCR4的表达与胃癌淋巴结的转移相关（P〈0.05）。结论 趋化因子受体CXCR4和CCR7在胃癌组织中高表达，其表达水平与胃癌的病理分化程度、临床分期等相关。     

趋化因子受体CCR7在非小细胞肺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的探讨非小细胞肺癌中趋化因子受体CCR7的表达及其临床意义。方法采用免疫组化和RT-PCR法检测40例非小细胞肺癌中CCR7的表达（鳞癌23例,腺癌14例,腺鳞癌3例）,阴性对照标本采用20例癌旁正常肺组织。结果免疫组化显示CCR7在25例（62.5%）非小细胞肺癌组织中表达和1例（5%）癌旁正常肺组织中表达,差异具有显著意义（P〈0.01）;RT-PCR显示CCR7 mRNA在29例（72.5%）非小细胞肺癌组织中表达和2例（10%）癌旁正常肺组织中表达,差异具有显著意义（P〈0.01）。CCR7表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、分化程度、局部浸润有关,但与年龄、性别、肿瘤大小、病理类型无关。免疫组化和RT-PCR法显示CCR7表达对肺癌淋巴结转移判断的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为95.9%（100%）、77.8%（61.1%）、84%（75.9%）、93.3%（100%）。结论CCR7在非小细胞肺癌中高表达,且与淋巴结转移密切相关,是肺癌淋巴结转移的独立危险因素,CCR7的表达可作为预测NSCLC患者淋巴结转移的临床候选指标之一,对指导肺癌的靶向治疗具有一定价值。     

TNF-α基因转染增强树突细胞迁移及CCR7受体表达

为探讨腺病毒介导肿瘤坏死因子－α（TNF－α）基因转染诱导树突细胞（DCs)趋化因子受体差异性表达，分别用100MOI的AdV-TNF－α和AdV-pLpA(无外源基因插入）感染小鼠树突细胞（mDCs)，经流式细胞仪检测细胞表型变化，RNA酶保护实验检测其趋化因子受体表达，体内、体外细胞趋化试验分析比较其迁移差异。发现AdV-TNF－α感染mDCs后CD11b、CD40、CD86、ICAM－1以及CC7授 体表达较对照组明显增高，CCR2受体表达量却下调；体外细胞趋化试验表明DCTNF－α对MIP－3β（CCR7配体）迁移应答增强，体内细胞趋化试验显示DCTNF－α淋巴结趋化迁移效率较空白对照组和AdV-pLpA感染组分别增高7倍和3倍。提示：AdV-TNF－α感染促使mDCs成熟，增强其次级淋巴结趋化迁移效率。     

反义肽核酸阻断人神经母细胞瘤多药耐药相关蛋白P-糖蛋白的表达

目的探讨反义肽核酸(PNA)的细胞转染方法及其对体外培养的神经母细胞瘤多药耐药(MDR)相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法以人MDR-1基因mRNA为靶点设计合成两反义PNA序列,利用PNA-DNA杂交,阳离子脂质体介导转染神经母细胞瘤耐药细胞株SK-N-SH.采用流式细胞术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和高效液相色谱等方法分别检测反义PNA的转染效率,转染前后细胞P-gp、MDR-1基因mRNA的表达及细胞内阿霉素(ADM)浓度.结果荧光标记的反义PNA转染肿瘤细胞后,细胞平均荧光强度显著增强,呈浓度依赖性.两反义PNA均使SK-N-SH细胞P-gp表达明显降低,MDR-1 mRNA表达轻度降低,细胞内ADM聚集浓度明显增加.结论PNA-DNA杂交阳离子脂质体转染法可有效增加细胞对PNA的摄取,特异序列的反义PNA可在一定程度上阻断神经母细胞瘤MDR相关蛋白P-gp的表达.     

反义B7-H1对人树突状细胞生物学特性的影响研究

目的研究反义B7-H1基因转染对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)生物学特性的影响.方法以稳定表达反义B7-H1的重组腺病毒Ad.ASB7-H1转染DCs,转染后1、3、5、7及9 d以流式细胞术检测转染DCs表面B7-H1、CD1、CD14、D80、CD83及HLA-DR的表达,ELISA技术检测Ad.ASB7-H1转染DCs培养上清中IL-12的水平,3H-TdR掺入法检测Ad.ASB7-H1转染DCs诱导的T淋巴细胞增殖能力.结果反义B7-H1转染DCs后可明显抑制细胞表面B7-H1表达,其抑制效应在转染后24 h即开始出现.对DCs其他粘附分子表型表达无明显影响.Ad.ASB7-H1转染DCs刺激同种异体混合淋巴细胞反应能力增强;Ad.ASB7-H1转染DCs分泌IL-12能力提高.结论Ad.ASB7-H1转染可抑制DCsB7-H1的表达并使DCs生物学行为发生改变,反义B7-H1可能成为提高DCs疫苗生物学效能的一个潜在靶点.     

铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究

目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响.方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列.分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用.利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况.qPCR方法检测lasR mRNA表达.结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸.不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强.结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达.     

STAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达中的作用

目的 探讨STAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞(human monocytederived dendritic cells,moDCs)趋化因子受体7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)表达中的作用.方法 采用CD14+磁珠分离法从外周血中分离得到单核细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4在体外诱导培养树突状细胞.LPS用于刺激moDCs表达CCR7,RT-PCR检测不同浓度IL-6处理后再用LPS刺激后的moDCs CCR7 mRNA表达.Western blot检测IL-6处理moDCs和IL-6预处理后再加入STAT3磷酸化特各异性抑制剂JSI-124的moDCs STAT3、p-STAT3表达.IL-6预处理并抑制STAT3磷酸化后,LPS刺激48 h,RT-PCR检测moDCs CCR7 mRNA的表达,流式细胞仪检测moDCs CCR7蛋白表达,细胞迁移实验检测moDCs细胞迁移功能.结果 与单独LPS刺激组比较,IL-6明显抑制LPS刺激的moDCs CCR7mRNA的表达(P＜0.05).Western blot结果显示,与单独LPS刺激组比较,IL-6导致moDCs细胞内STAT3高度活化;而抑制STAT3信号高度活化后,与IL-6+LPS处理组比较,moDCs CCR7 mRNA表达、蛋白分子表达、细胞迁移能力明显升高(P＜0.05),与LPS刺激组无差异(P＞0.05).结论 IL-6通过高度活化STAT3信号通路抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达,导致树突状细胞的迁移能力受损,而靶向干预STAT3通路可能成为纠正树突状细胞迁移障碍的潜在手段.     

活动期类风湿关节炎患者外周血树突状细胞CCR5和CCR7的检测及意义

目的 观察活动性类风湿关节炎(RA)患者不同活动期树突状细胞(DCs)表面趋化因子受体CCR5和CCR7的表达,评价其与疾病活动指标的相关关系.方法 选取28名RA患者以DAS28评分分为:低活动组、中活动组和高活动组,10名正常健康人为正常组,体外分离和培养RA患者DCs.采用流式细胞仪检测RA患者DCs表面CCR5和CCR7的表达.采用直线相关分析CCR5、CCR7和RA患者类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)与抗CCP抗体的相关关系.结果 DCs表面CCR5、CCR7在RA不同疾病活动性中有差异表达,CCR5和CCR7的表达与RF和CRP有直线相关关系,与抗CCP抗体无显著相关.结论 RA患者外周DCs表面CCR5和CCR7的表达与RA疾病活动有相关关系,可能成为监测RA疾病活动和治疗效果的指标.     

反义肽核酸阻抑线粒体基因表达诱导肺癌SPC细胞凋亡的实验研究

目的:探讨以反义肽核酸(Anti-sense peptide nucleic acid,asPNA)封闭肺癌SPC-A1细胞线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)转录启动子后,对其生物学特性的影响.方法:合成针对mtDNA重链转录启动子区的asPNA,构建asPNA-三苯磷复合物并鉴定,以该复合物转染人肺腺癌SPC-A1细胞系.激光共聚焦显微镜确定该复合物的亚细胞定位,RT-PCR检测转染48h后对mtDNA编码基因转录的影响,流式细胞术评估细胞周期分布及凋亡/坏死情况,自发光荧光仪检测细胞内ATP浓度,以未转染asPNA-三苯磷复合物的肺腺癌SPC-A1细胞为对照.结果:成功获得asPNA-三苯磷复合物,激光共聚焦显微镜显示该复合物顺利进入SPC-A1细胞线粒体;同未转染组相比,转染组SPC-A1细胞mtDNA编码基因的转录水平有所下降,而细胞内ATP浓度明显降低(P＜0.01);同时,细胞周期分析显示,转染组出现明显的亚二倍体峰,而Annexin V-PI双标结果进一步证实,转染组肺癌细胞凋亡率明显增加.结论:asPNA在电子移位亲脂性阳离子-三苯磷的运载下,能够进入SPC-A1细胞线粒体并阻抑其mtDNA编码基因的转录,进而影响肺癌细胞的能量合成并诱导其凋亡.     

CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建趋化因子受体CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组载体并获取重组腺病毒以用于抗HIV-1基因治疗的研究.方法:用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中分别扩增出趋化因子受体CCR5,CXCR45′端翻译起始区653bp和636bp的cDNA片段,将其反向插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV中,再与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌同源重组,卡那抗性培养基筛选阳性克隆;同源重组的载体用脂质体转染剂转染293细胞包装、扩增,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)以及PCR法鉴定、氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒.结果:成功构建了CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体,并于293细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒,其滴度为:7.2×1012PFU/mL.结论:CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒的构建为研究双靶位辅助受体反义RNA抗HIV-1的作用打下基础.     

肽核酸在疾病诊疗和分子生物学研究中的应用

肽核酸是一种新型的以多肽为骨架，类似核苷酸且不带电荷的物质。肽核酸在疾病诊疗和分子生物学研究中的反义药物、反基因药物、探针、PCR技术等方面有广泛应用。     

多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因高效反义肽核酸序列筛选及其体外抗菌活性观察

目的 筛选出能与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA紧密结合的反义肽核酸序列,评估其体外抗菌活性.方法 利用Mfold、RNA Structure 4.6两种计算机软件对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA进行二级结构分析计算,根据最低自由能原则在其mRNA局部杂交松弛区设计反义寡核苷酸,与体外转录的地高辛标记的gyrAmRNA进行斑点杂交,根据杂交信号的强弱筛选出与gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸,根据其序列合成肽核酸(pep-tide nucleic acid,PNA),另加设1条与靶序列有6个碱基错配的PNA作为阴性对照,2条PNA分别连接穿膜肽形成肽-肽核酸(peptide-PNA,PPNA).测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度[D(600)]值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用,采用RT-PCR检测gyrA mRNA的表达水平.结果 斑点杂交结果显示,计算机软件设计的10条反义寡核苷酸探针中有5条与gyrA mRNA显示出杂交信号,其中1条信号最强,能够与gyrA mRNA稳定结合,将其以肽-肽核酸的形式合成处理细菌,结果表明其在5 μmol/L浓度可完全抑制gyrA mRNA的表达,并抑制鲍曼不动杆菌的生长,在10μmol/L浓度具有杀菌活性,而具有错配碱基的PPNA对细菌生长无明显抑制作用.结论计算机辅助设计联合斑点杂交可在体外模拟体内环境对寡核苷酸与靶基因结合的有效性进行验证,实现在体外高通量筛选高效反义序列.经筛选得到的靶向gyrA基因反义肽-肽核酸可在体外高效抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长.