重组腺病毒介导hTIMP-1对人肝癌细胞系体外增殖的影响

目的探讨人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（hTIMP-1）过表达对人肝癌细胞系HepG2体外增殖的作用。方法构建携载hTIMP-1全长cDNA的重组腺病毒载体,感染HepG2细胞,应用Western blot及RT-PCR方法检测TIMP-1蛋白及mRNA的表达,透射电镜观察细胞超微结构改变,MTT法检测hTIMP-1对HepG2细胞生长的影响。结果成功构建携载hTIMP-1的重组腺病毒载体,感染HepG2细胞,实现其体外稳定表达,hTIMP-1过表达对HepG2体外增殖有明显抑制作用。结论hTIMP-1过表达可抑制人肝癌细胞系HepG2的体外增殖,可用于肝癌基因治疗的研究。     

人血管生成抑制分子的分子克隆与真核表达

目的　克隆人血管生成抑制分子 (METH1)全长cDNA ,建立稳定表达人METH1分子的哺乳动物细胞系。方法　RT PCR获取人METH1cDNA ,序列测定后克隆人真核表达载体pCDNA3 0中 ,用脂质体转染入HepG2细胞 ,G4 18筛选出稳定表达细胞系 ,用RT PCR与Westernblot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果　RT PCR扩增得到预期大小的目的条带 ,序列分析表明成熟肽编码区与发表序列 [GI∶5 72 5 5 0 5 ]完全一致 ;克隆人pCDNA3 0中得到METH1真核表达载体 ,G4 18筛选 3周后得到稳定表达细胞系 ,RT PCR与Westernblot显示METH1在HepG2细胞中有高水平表达。结论　人METH1全长cDNA成功克隆 ,并在哺乳动物细胞系HepG2中获得稳定表达 ,为进一步研究METH1分子对增生性瘢痕血管形成的作用奠定了理论基础。     

METH1基因截短体的构建及其对HUVEC细胞增殖的影响

目的筛选血管生成抑制因子METH1功能编码区基因片段,为进一步研究METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法设计METH1三种基因截短体,分别构建相应的重组pcDNA3.1真核表达载体,然后将其稳定转染入HUVEC细胞,用RT-PCR、Western-Blot方法检测其在细胞中的表达,最后,通过MTT及FCM法验证其对HUVEC细胞增殖的影响。结果获得了能稳定表达的三种截短体,其中METH1-T2同METH1一样具有明显抑制HUVEC细胞增殖的作用,而METH1-T1、METH1-T3抑制细胞增殖的效果不明显。结论所获METH1-T2为功能活性区片段,可以替代METH1全长进行抑制增生性瘢痕的分子机制研究。     

血管内皮生长因子-C shRNA对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 检测靶向血管内皮生长因子-C(vasenlar endothelial growth factor-C,VEGF-C)shRNA质粒载体对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 构建VEGF-C shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入肝癌HepG2细胞.通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞的转染率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF-C mRNA及蛋白的表达变化;MTT法检测细胞增殖抑制率;人工基底膜体外侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 VEGF-C shRNA稳定转染后,肝癌HepG2细胞内VEGF-C mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-C shRNA对肝癌HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑制增殖效应呈时间依赖性;VEGF-C shRNA可有效抑制肝癌HepG2细胞的人工基底膜体外侵袭能力,抑制率为51.54%.结论 VEGF-C在肝癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用;通过RNA干扰技术实现VEGF-C沉默,在肝癌的基因治疗中具有较好的应用前景.     

METH1基因截短体的构建及其对HUVEC细胞增殖的影响

目的筛选血管生成抑制因子METH1功能编码区基因片段,为进一步研究METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法设计METH1三种基因截短体,分别构建相应的重组pcDNA3.1真核表达载体,然后将其稳定转染入HUVEC细胞,用RT-PCR、Western-Blot方法检测其在细胞中的表达,最后,通过MTT及FCM法验证其对HUVEC细胞增殖的影响。结果获得了能稳定表达的三种截短体,其中METH1-T2同METH1一样具有明显抑制HUVEC细胞增殖的作用,而METH1-T1、METH1-T3抑制细胞增殖的效果不明显。结论所获METH1-T2为功能活性区片段,可以替代METH1全长进行抑制增生性瘢痕的分子机制研究。     

他克莫司在体外对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15增殖的影响

目的：研究他克莫司（tacrolimus ,FK506）在体外对肝癌肿瘤株HepG2和乙肝相关肝癌株HepG2.2.15增殖的影响。方法：体外培养肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15,采用MTT法、流式细胞技术,分别检测细胞增殖、细胞周期、CyclinA。结果：FK506可以显著抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖,其抑制增殖作用随剂量增加而增强;FK506诱导细胞产生G0/G1期阻滞,这种抑制作用有浓度依赖性;FK506对周期蛋白CyclinA表达的影响呈浓度负相关性,FK506浓度越高,周期蛋白CyclinA表达越少。结论：FK506可以抑制肝癌细胞HepG2和乙肝相关肝癌细胞HepG2.2.15的增殖,这种作用可能与诱导细胞周期阻滞有关。     

苦参碱对前列腺癌细胞增殖及雄激素受体功能的抑制作用

目的:探讨苦参碱(matrine)对雄激素依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP)的增殖及雄激素受体(androgen re-ceptor,AR)表达的抑制作用。方法:分别用0.5、1.0、1.5、2.0、3.0g/L浓度的苦参碱作用于LNCaP细胞12、24、36h后MTT法检测细胞生长活性;台盼蓝拒染法测定细胞生长曲线;24h后流式细胞仪测定细胞周期变化;24h后Western印迹法检测细胞内AR的表达。结果:苦参碱能抑制LNCaP细胞的生长,呈剂量与时间依赖性,不同浓度苦参碱组之间与不同作用时间组之间的差异均有显著性意义(P<0.01)。苦参碱诱导LNCaP细胞出现剂量依赖性G2/M期阻滞(P<0.01);细胞内AR的表达随苦参碱剂量依赖性减少(P<0.01)。结论:苦参碱通过下调细胞内AR表达和阻滞细胞周期进展来抑制LNCaP细胞的体外生长。     

熊果酸对HepG2增殖和凋亡的影响及部分机制研究

目的:观察熊果酸对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响及其部分机制的研究。方法:将不同浓度熊果酸体外培养人肝癌HepG2细胞,通过MTT法检测熊果酸对细胞增殖抑制的情况,利用流式细胞检测术观察熊果酸对细胞凋亡及细胞周期的影响。同时利用Western blot法检测不同浓度熊果酸干预后人肝癌HepG2细胞pERK1/2蛋白、Cyclin D1蛋白的表达情况。结果:不同浓度熊果酸对人肝癌HepG2细胞的增殖均有抑制效应,并呈剂量、时间依赖性(P<0.05);60μmol/L熊果酸作用于人肝癌细胞株HepG2 72 h后达到最大细胞凋亡率(78.723±3.623)%。熊果酸可明显增加G_0/G_1期的细胞含量,诱导人肝癌细胞株HepG2的凋亡。熊果酸可抑制pERK1/2蛋白、Cyclin D1蛋白的表达,并随着浓度、时间逐渐上调抑制作用更加明显。结论:熊果酸可抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,阻滞细胞期于G0/G1期,促进癌细胞凋亡,这一过程可能与下调细胞pERK1/2蛋白、Cyclin D1蛋白的表达有关。     

去甲斑蝥素诱导人鼻咽癌细胞CNE1凋亡的实验研究

目的检测去甲斑蝥素对人鼻咽癌细胞CNE1增殖、凋亡的影响,为临床应用NCTD治疗鼻咽癌细胞提供实验基础。方法体外常规培养CNE1细胞用于实验,经NCTD作用后,采用MTT比色法检测细胞增殖情况,流式细胞仪观察鼻咽癌细胞凋亡、细胞周期。结果 NCTD对鼻咽癌细胞的生长有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;NCTD可剂量和时间依赖性地诱导肿瘤细胞凋亡;NCTD可剂量依赖性地诱导肿瘤细胞周期发生改变,将鼻咽癌细胞阻滞在G2期。结论 NCTD对体外培养的CNE1细胞的生长有明显抑制作用和诱导凋亡的作用。     

奥曲肽对人结肠癌细胞生长增殖抑制作用的研究

目的研究不同浓度的生长抑素类似物奥曲肽对人结肠癌SW480细胞生长增殖的抑制作用。方法体外培养人结肠癌SW480细胞,MTT比色法测定不同浓度奥曲肽抑制SW480细胞增殖作用,以效价强度最高者为最佳抑制浓度;平皿集落形成法测定奥曲肽抑制体外培养SW480细胞的锚定依赖性生长作用。结果不同浓度奥曲肽对SW480细胞增殖活性具有不同程度的抑制作用,在1×10^-10～1×10^-8mol/L浓度范围内呈剂量依赖性,其中1×10^-8mol/L为最佳抑制浓度;奥曲肽对SW480细胞锚定依赖性生长具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。结论奥曲肽能抑制体外培养的人结肠癌SW480细胞生长增殖,并在一定范围内呈浓度与时间依赖性。     

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽的白细胞介素-24突变体真核表达载体的构建及其体外抗肝癌作用

目的 构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)真核表达质粒,观察其对肝癌细胞的抑制作用.方法 利用重叠PCR技术在IL-24cDNA中插入GGT三个碱基,获得RGD-IL-24 cDNA.将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/RGD-IL-24.将pcDNA3-1/RGD-IL-24及作为对照的pcDNA3.1/IL-24转染肝癌细胞HepG2,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-24 mRNA表达;Western blot检测IL-24蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡;Western blot检测bax、bcl-2表达.结果 测序证明pcDNA3.1/RGD-IL-24构建成功.RT-PCR、Western blot证实转染pcDNA3.1/RGD-IL-24的肝癌HepG2细胞表达IL-24.pcDNA3.1/RGD-IL-24、pcDNA3.1/IL-24处理组HepG2细胞存活率分别为(0.382±0.064、0.563±0.038),凋亡细胞阳性率分别为(0.346±0.049、0.163±0.087),两组差异均有统计学意义.Western blot证实pcDNA3.1/RGD-IL-24促进bax表达、抑制bcl-2表达作用强于pcDNA3.1/IL-24.结论 RGD-IL-24真核表达质粒不仅不影响IL-24表达,且能显著增强IL-24诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长作用.     

乙型肝炎病毒x蛋白对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白 (hepatitisBvirusxprotein ,HBx)在体内外对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将携带HBx基因的表达质粒 pHA HBx转染HepG2细胞 ,通过检测细胞生长曲线、倍增时间和3 H TdR掺入率观察HBx对细胞增殖活性的影响 ;将整合HBx基因的HepG2细胞接种裸鼠 ,建立表达HBx的人肝癌裸鼠模型 ,用阿霉素进行裸鼠腹腔化学药物治疗 ,观察肝癌组织的生长状况 ;用TUNEL方法检测切除的裸鼠癌标本中凋亡细胞的比例。结果转染HBx基因的HepG2细胞倍增时间为 2 8 5h ,对照组为 32 5h ;3 H TdR掺入率 :转染HBx基因组为 (10 2 1± 78)cpm ,对照组为 (85 9± 6 9)cpm ,转染组细胞明显高于对照组细胞 (t =2 5 4 ,P <0 0 1) ;转染HBx基因的细胞在裸鼠体内形成的癌重量为 (3 10± 0 39) g ,对照组癌重量为 (2 6 1± 0 2 8) g ,两组之间差异有显著意义 (t=2 0 3,P <0 0 5 ) ;裸鼠腹腔化学药物治疗后 ,转染组的癌细胞凋亡为 3 5±0 75 ,对照组为 2 2 5± 6 5 ,转染HBx基因的细胞凋亡明显减少 (χ2 =6 6 9,P <0 0 1)。结论HBx可以提高HepG2细胞的增殖活性 ,促进裸鼠体内肝癌生长 ,对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡具有抑制作用。     

PNP-CD融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 分析PNP-CD融合自杀基因系统对肝癌细胞HepG2的杀伤作用并探讨其可能的机制.方法 利用重组PCR定点诱变法制备融合基因PNP-CD.将PNP-CD插入真核表达载体pcDNA3.0中,构建融合自杀基因表达载体pcDNA3.0/PNP-CD.经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染pcDNA3.0/PNP-CD的抗性细胞克隆.用RT-PCR和Western Blotting法检测PNP-CD基因在HepG2细胞中的表达.用台盼蓝排斥法检测细胞生长曲线,用MTT法检测细胞细胞克隆对相应前药敏感性及所导致的旁观者效应.结果 融合基因片段PNP-CD正确插入了pcDNA3.0中,pcDNA3.0/PNP-CD在HepG2细胞中实现了表达.细胞抗性克隆对特定的前药高度敏感.在两种前药联合作用下,pcDNA3.0/PNP-CD所致旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药所致旁观者效应.结论 具有双自杀基因功能的PNP-CD融合基因系统是肝癌基因治疗中一种高效治疗载体,对肝癌细胞有着良好的杀伤作用.     

细胞周期素D1反义cDNA治疗肝癌的研究

目的 通过基因反义封闭技术抑制细胞周期素D1（CydinD1）的表达，研究其对肝癌细胞增殖以及成瘤性的影响。方法 以肝癌HepG2细胞株为研究对象，通过转染可表达CyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察CyclinD1反义cDNA对肝癌细胞CyclinD1基因表达、体外增殖活性及裸鼠体内成瘤性的影响。结果 噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性显示转染表达反义CydinD1的质粒后，HepG2细胞的增殖受到抑制．抑制作用在48h左右最强；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测显示CyclinD1 mRNA基因的表达明显被抑制；间接免疫荧光检测结果显示CyclinD1蛋白表达显著降低；流式细胞仪检测结果显示G0／G1期的细胞比例增高，G2＋M和S期的细胞比例下降，HepG2细胞周期在G1期被阻滞；裸鼠成瘤试验显示肝癌HepG2细胞的成瘤性受到明显抑制。结论 CyclinD1反义cDNA可以特异性的抑制肝癌HepG2细胞株CyclinD1蛋白的表达，从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖及体内成瘤性。CyclinD1反义cDNA对于肝细胞癌的生物治疗具有一定的应用前景。     

慢病毒介导的microRNA-21-siRNA对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响

目的 通过构建慢病毒介导( lentivirus,LV)的microRNA-21-siRNA,探讨下调microRNA-21对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响.方法 针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,将重组microRNA-21-RNAi-LV转染肝细胞癌HepG2.体外设为干扰组(microRNA-21 -siRNA,SI组)、阴性对照组(negative control,NC组)和正常组(normal,N组);分别采用聚合酶链反应方法检测microRNA-21目的基因的表达的情况;用噻唑蓝比色法检测增殖情况、transwell小室迁移实验检测迁移情况、Hochest33258凋亡实验检测凋亡情况.体内实验设为SI组和NC组,观察反义microRNA-21对裸鼠移植瘤生长的影响.结果 (1)micmRNA-21 -RNAi-LV可显著降低microRNA-21的表达.(2) MTT实验96h后SI组增殖能力显著低于NC组和N组(P=0.0031,P＜0.05).(3)迁移能力减弱(P =0.0004,P＜0.05).(4)SI组细胞凋亡明显增加,促凋亡基因caspase3基因表达上调(P =0.0002,P＜0.05).(5)各组裸鼠皮下肿瘤生长比较差异无统计学意义(P=0.0624,P＞0.05).结论 microRNA-21 -siRNA通过抑制microRNA-21的表达抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,降低其迁移能力.     

HCCR-2反义核酸对肝癌HepG2细胞的作用

目的 研究反义HCCR-2真核表达载体对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.方法 构建反义HCCR-2真核表达载体(反义载体组),转染肝癌HepG2细胞,G418筛选阳性克隆,同样方法获得空载体pIRES2-EGFP稳定表达的细胞株(空载体组),取肝癌HepG2细胞为对照(肝癌HepG2组),用MTT法、流式细胞仪、透射电镜观察反义HCCR-2转染前后肝癌HepG2细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡及细胞形态的变化.采用单因素方差分析和χ2检验比较各组差异.结果 反义载体组、空载体组、肝癌HepG2组HCCR-2 mRNA表达水平分别为0.39±0.04、0.62±0.06、0.72±0.03,3组比较差异有统计学意义(F=43.701,P<0.05);细胞凋亡率分别为13.30%、2.51%、2.07%,反义载体组与空载体组、肝癌HepG2组比较,差异有统计学意义(χ2=6.793,8.721,P<0.05);反义载体组细胞生长减慢,阻滞于G0/G1期.结论 HCCR-2反义核酸真核表达载体能抑制HCCR-2 mRNA的表达,促进细胞凋亡,HCCR-2蛋白可能参与肝癌细胞的周期调控,并与细胞的生长增殖有关.