麦冬皂苷D通过降低自噬抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大

目的麦冬皂苷D是否抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所引起的心肌肥大及其可能机制。方法体外培养大鼠心肌细胞系H9c2,MTS法检测麦冬皂苷D的细胞毒性;其次将1μmol·L~(-1)的AngⅡ作用于H9c2细胞24h后引起心肌肥大,用不同浓度的麦冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)共处理,BCA法检测总蛋白含量;实时荧光定量PCR技术检测标志性肥大基因BNP和β-MHC的mRNA表达;Western blot法检测自噬蛋白LC3B的表达,同时运用高内涵筛选技术检测心肌细胞自噬蛋白LC3B的表达以及线粒体膜电位的改变。结果细胞活力的检测结果显示,与对照组相比,AngⅡ不同浓度作用24 h后,对细胞活力无明显影响,而麦冬皂苷D的高浓度(50~100μmol·L~(-1))可明显抑制细胞的活性;AngⅡ作用于心肌细胞24h后,可引起心肌肥大,导致特异性肥大基因mRNA表达上调,并且明显增加细胞总蛋白含量;同时使心肌细胞自噬增强;线粒体膜电位降低,而麦冬皂苷D共处理能明显逆转上述指标。结论麦冬皂苷D对AngⅡ所诱导的心肌肥大有抑制作用。     

3D血脑屏障类器官氧糖剥夺模型的构建及冠心宁注射液的保护作用探究

血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)在维持中枢神经系统稳态方面发挥着重要作用。在许多神经系统疾病如缺血性脑卒中、阿尔茨海默症等疾病中都会出现BBB损伤。中医药对于防治缺血性脑卒中潜力巨大,但临床相关模型的缺乏已成为其应用开发的瓶颈。本研究采用了由人脑微血管内皮细胞(HBMEC)、人脑星形胶质细胞(HA)和人脑血管周细胞(HBVP)组成的BBB类器官模型,并建立了细胞活力、屏障通透性及BBB标志物表达的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)条件。然后在该类器官模型中研究了中药冠心宁注射液(GXNI)对OGD/R诱导的BBB功能障碍的保护作用。结果表明, OGD/R降低BBB类器官细胞活力,增加屏障通透性(渗漏),降低紧密连接蛋白闭塞带-1 (ZO-1)、claudin-5、闭塞素和P-糖蛋白(P-gp)的水平。GXNI可显著阻止OGD/R诱导的BBB破坏,如细胞活力降低和通透性增加。本研究为中枢神经系统靶向药物的研发提供了一种新的人类细胞源性3D缺血性脑病模型,并证明了中药GXNI在体外可有效保护BBB功能障碍。     

不同剂量前列腺素E2对H9c2心肌细胞肥大的影响

目的:研究前列腺素E2(PGE2)对H9c2心肌细胞的肥大作用,并分析其量效关系,为寻找抗心肌肥大的潜在靶点提供理论依据.方法:将H9c2心肌细胞分为空白对照组(C组)和PGE2处理组,PGE2处理组又分为小剂量PGE2组(D1组)、中剂量PGE2组(D2组)和大剂量PGE2组(D3组).各组细胞培养液中PGE2终浓度分别为0、0.1、1及10 μmol/L.给药孵育48 h后,利用荧光显微镜观察大鼠H9c2心肌细胞形态及体积;通过测量细胞直径大小、BCA法测定细胞总蛋白含量来确定心肌细胞是否肥大;RT-PCR技术测量心钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(Brain natriuretic peptide,BNP)mRNA的表达水平,以此判断是否发生病理性肥大.结果:与C组比较,免疫荧光显示D1组、D2组及D3组细胞形态改变、体积增大;细胞直径及总蛋白含量显著增加(P＜0.05),不同剂量PGE2组间亦具有统计学差异(P＜0.05);D2组及D3组较C组细胞内ANP、BNP mRNA表达水平显著增高(P＜0.05).结论:PGE2可剂量依赖地诱导H9c2心肌细胞肥大,较大剂量PGE2引发心肌细胞病理性肥大.抑制PGE2合成有望为抑制心肌肥大提供靶点.     

缺血预处理对离体心肌线粒体膜电位的影响

目的 研究缺血预处理(IP)对离体大鼠心肌线粒体膜电位的影响.方法 采用Langendorff装置建立大鼠离体心肌缺血再灌注模型,将SD大鼠随机分为正常对照组(CON)、缺血再灌注损伤组(IR)、缺血预处理组(IP)、5-羟葵酸(5-HD)拮抗缺血预处理组(5HD IP),每组6只.各组平衡末、缺血前、再灌注末分离心肌线粒体并测定线粒体膜电位.结果 再灌注末,缺血预处理组线粒体膜电位显著高于缺血再灌注组(P＜0.01),5HD IP组线粒体膜电位较lP组差异有显著性(P＜0.05).结论 缺血预处理能明显减轻离体心脏缺血/再灌注对大鼠心肌线粒体膜电位功能的损害,而5HD能部分废除该作用.     

血管紧张素Ⅱ致心肌肥大及机制

心肌肥大是一个适应性的生理过程,它可以引起呼吸困难、心绞痛、晕厥、头晕、心悸等症状.无论是血压还是血容量增加都会造成左心室的肥大(LVH),这种肥大是以心脏和血管结构改变以及心肌重建为特征的.左心室肥大过程中细胞的紊乱是心室组织两类主要细胞即心肌细胞和纤维原细胞改变引起的.大部分关于心肌肥大的研究,都常使用培养的新生大鼠心室细胞(NRVMs).在心脏病变过程中,心肌细胞的肥大使心脏变大,同时伴随着单个细胞的增大,使收缩蛋白质如肌球蛋白重链的含量增加,并使诸如编码心钠素(ANF)的胚胎基因等过度表达.     

附子对H9c2心肌细胞系线粒体的毒性作用机制

目的研究附子对H9c2心肌细胞的线粒体毒性作用与机制。方法附子水提取物6.25,12.5,25,50和100 g·L-1作用于H9c2细胞24 h,荧光染色和CCK-8法检测细胞存活率;附子水提取物6.25,12.5和25 g·L-1作用于H9c2细胞24 h,流式细胞仪检测线粒体膜电位和活性氧(ROS)生成的变化;使用相应的荧光探针,结合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+、线粒体内Ca2+以及线粒体内超氧化物水平的变化;萤火虫荧光素法检测细胞内ATP浓度变化;实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖活化受体共激活因子-1α(Pgc-1α),Bcl-2和Bax m RNA的表达;Western蛋白印迹法检测Pgc-1α蛋白的表达。结果附子水提取物12.5~100 g·L-1作用于H9c2细胞,可显著抑制细胞活性(P<0.05),IC50值为47.4669 g·L-1,95%的可信限32.5997~69.1145 g·L-1。附子水提取物25 g·L-1处理后,ROS的荧光强度由正常对照组的204±67升高到454±78(P<0.05),线粒体超氧化物的荧光强度由5.4±1.8升高到26.8±8.5(P<0.01),线粒体膜电位由1.7±0.5下降到0.8±0.4(P<0.05),线粒体内Ca2+的荧光强度由38.0±4.3下降到9.2±1.6(P<0.01),细胞内Ca2+的荧光强度由7.8±0.8升高到22.1±0.5(P<0.05),细胞内ATP浓度由(10.6±0.4)μmol·g-1下降到(5.3±1.1)μmol·g-1蛋白(P<0.05)。实时荧光定量PCR和Western蛋白印迹检测结果显示,与正常对照组相比,附子水提取物25 g·L-1组Pgc-1α和Bcl-2的m RNA表达分别由正常对照组的1.00±0.10和1.00±0.10下降到0.09±0.06(P<0.01)和0.43±0.06(P<0.01),Bax m RNA表达由1.00±0.03升高到1.17±0.06(P<0.05);Pgc-1α蛋白表达由正常对照组的0.906±0.034下降到0.541±0.003(P<0.01)。结论附子对心肌细胞具有一定的线粒体毒性,其作用是多种途径共同作用的结果。附子的心肌线粒体毒性可能是附子造成心肌毒性的原因。     

吡格列酮体外对大鼠心肌肥大的改善作用

目的　探讨噻唑烷二酮 (TZD)类药物吡格列酮在体外对心肌肥大的影响。方法　新生大鼠的原代培养心肌细胞和非心肌细胞 ,以血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )刺激建立体外心肌肥大模型 ,并用不同浓度的吡格列酮作用细胞。采用RT PCR法检测心肌肥大特征性基因心钠肽 (ANP)和脑钠肽(BNP)的mRNA表达 ,以MTT比色法和3 H TdR参入实验检测非心肌细胞增殖情况 ,以3 H 亮氨酸参入实验检测心肌细胞蛋白合成速率 ,并用软件分析心肌细胞表面积。结果　肥大模型出现后 ,心肌细胞表面积、ANP和BNP的mRNA表达以及蛋白合成速率增加 ;非心肌细胞增殖活跃 ,但ANP和BNP的mRNA表达没有变化。吡格列酮可以逆转这些变化 ,同时下调非心肌细胞的ANP和BNP的mRNA表达 ,并呈一定的剂量依赖性。结论　吡格列酮体外对大鼠心肌肥大有改善作用 ,预示着TZD类药物具有防治心肌肥大等心血管疾病的药理作用     

灯盏乙素对PC12细胞拟缺血性损伤的保护作用研究

目的:研究灯盏乙素对PC12细胞拟缺血性损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法:用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)加缺糖复制PC12细胞拟缺血模型。以MTT法检测细胞存活率并进行乳酸脱氢酶(LDH)活力测定;应用Hoechst33342染色法证明凋亡细胞的存在;应用流式细胞仪检测凋亡细胞的比率及线粒体膜电位的变化;应用激光共聚焦显微镜观察灯盏乙素作用下细胞内钙离子(Ca2+)浓度的变化。结果:在10-7～10-5mol.L-1范围内,灯盏乙素可增加损伤细胞的存活率,降低缺血性损伤所致培养介质内LDH的释放,具有浓度依赖性;灯盏乙素还可降低PC12拟缺血性损伤细胞的凋亡百分率和稳定细胞线粒体跨膜电位,降低细胞内Ca2+浓度,具有浓度依赖性。结论:灯盏乙素对PC12细胞拟缺血性损伤有显著保护作用,其机制可能与稳定细胞线粒体跨膜电位与抑制Ca2+内流有关。     

心脏类器官的研究进展及在药物发现研究中的应用

心血管疾病是人类卫生健康的重要威胁,也是药物研发的重要研究领域。类器官是利用干细胞的自我更新和分化能力,通过体外培养构建的一类与真实器官结构和功能类似的微器官。由于心脏类器官具备人源性、更贴近体内的结构和功能、可实现自组装及遗传稳定性好的特点,其在心脏发生发育研究、心血管疾病模型构建药物研发领域中的应用受到广泛关注。因此,本文将对近年来心脏类器官的发展与构建策略、心脏类器官在药物研发领域中的应用及该技术的前景进行讨论。     

三维HepaRG细胞模型的建立及对曲格列酮肝毒性评价

目的利用人肝癌HepaRG细胞系建立3D肝细胞模型,并应用该模型对抗糖尿病药物曲格列酮所诱导的肝毒性进行评价。方法采用低吸附法构建3D HepaRG细胞/组织模型。3D HepaRG细胞给予曲格列酮(3.125、6.25、12.5、25和50μmol/L)处理不同时间后,应用Alamar blue法测定细胞存活率,高内涵成像分析检测线粒体活性氧自由基、线粒体膜电位和线粒体丰度,以评价曲格列酮引起的肝细胞损伤。结果以1000或3 000个细胞/孔密度接种细胞,细胞在第3天自发聚集形成致密的球形,第7天后可形成稳定球体。曲格列酮可剂量依赖性地降低3D HepaRG细胞的存活率,诱导3D细胞线粒体损伤,表现为线粒体活性氧自由基生成增加,线粒体膜电位和线粒体丰度下降。结论采用低吸附法成功构建了3D HepaRG模型并应用该模型阐明曲格列酮诱导的肝毒性特征,提示3D HepaRG模型在评估药物性肝损伤等肝毒性测试中具有潜在的重要应用价值。     

左卡尼汀对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥厚的保护作用及机制研究

目的观察左卡尼汀(L-carnitine)对异丙肾上腺素(Iso)诱导的大鼠心肌肥厚的保护作用,并探讨其心肌保护作用的可能机制。方法应用异丙肾上腺素(Iso)制备SD大鼠心肌肥厚模型。40只健康大鼠,随机分成正常对照组(空白组)、异丙肾上腺素组(Iso组)、左卡尼汀组(L-carni-tine组)和普萘洛尔组(propranolol组)各10只。除空白组外各组大鼠均皮下注射(sc)Iso 10 d制成心肌肥厚模型。大鼠饲养到期后,检测心脏功能和心脏重量指数;制备心室肌石蜡切片,行Masson染色,光镜下观察心肌形态;测定大鼠心肌组织中的游离脂肪酸(FFA)、乳酸(LAC)和羟脯氨酸(Hpy)水平。分离心肌细胞进行线粒体膜电位(MMP)的测定。结果相比Iso组,L-carnitine组大鼠心脏功能改善,心脏重量指数降低;光镜下观察:心肌细胞肥大程度较Iso组减轻,心肌纤维排列整齐,胶原纤维增生较少;脂肪酸(FFA)、乳酸(LAC)和羟脯氨酸(Hpy)水平增高;心肌线粒体膜电位升高。结论应用L-carnitine在一定程度上可以抑制心肌肥厚的发展,其机制可能与改善能量代谢和细胞线粒体的功能有关。     

岩大戟内酯B对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响

目的:探讨岩大戟内酯B(jolkinolide B)诱导人乳腺癌Bcap37细胞凋亡及其可能机制。方法:分别应用MTT和AnnexinV-FITC/PI双染法检测jolkinolide B对Bcap37细胞的生长抑制率和细胞凋亡率;用流式细胞仪检测线粒体膜电位和细胞内游离Ca2+浓度的变化;RT-PCR检测jolkinolide B对Bcap37细胞caspase-3mRNA表达的影响。结果:jolkinolide B可显著抑制Bcap37细胞的增殖,呈剂量和时间效应关系;随jolkinolide B剂量增加,细胞凋亡率明显增加;线粒体膜电位下降,并伴有细胞内游离钙浓度增加,与对照组相比差异显著(P<0.01),同时caspase-3mRNA表达水平明显增高。结论:jolkinolide B可通过提高细胞游离Ca2+水平,激活内源性线粒体信号转导途径而诱导Bcap37细胞凋亡。     

NHE1抑制剂对缺血及再灌流心肌的保护作用

心肌缺血时 ,由于细胞内 pH值下降 ,激活了Na+/H+交换泵 (NHE) ,细胞内Na+浓度升高 ,促进Na+ Ca2 +交换 ,最终导致细胞内Ca2 +超负荷 ,造成细胞损伤。NHE1抑制剂可通过抑制Na+/H+交换 ,防止细胞内Ca2 +超负荷及其他相关作用 ,对缺血再灌注心脏起保护作用 ,改善心肌功能。目前部分NHE1抑制剂已进行临床研究。     

心肌肽素抗培养心肌细胞缺氧再给氧损伤作用

目的　观察小分子多肽类物质心肌肽素对缺氧 再给氧损伤培养心肌细胞的保护作用。方法　建立培养心肌细胞缺氧 再给氧损伤模型 ,分别以荧光微量法和光化学扩增法检测心肌细胞内脂质过氧化反应终产物MDA的含量及细胞内SOD活性 ,线粒体脱氢酶活性用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定。结果　心肌肽素可剂量依赖性地降低MDA的含量 ,提高SOD活性及增强受损细胞内线粒体脱氢酶活性。结论　心肌肽素对缺氧 再给氧损伤培养心肌细胞具有保护作用     

姜枣合用对D-半乳糖致衰小鼠钙稳态影响的实验研究

目的:观察:1姜枣合用对维持细胞内钙稳态的作用2中药维持细胞内钙稳态机制的初步探讨。方法:本实验以D-半乳糖衰老小鼠为研究对象,以按照不同比例姜枣混合的水煎剂灌胃4 5 d,测定了青年、老年小鼠红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,心肌线粒体内丙二醛(MDA )含量,心肌细胞膜Na - K - ATPase、Ca2 - ATPase活性,心肌组织及线粒体Ca2 含量变化。结果:姜枣合用可提高小鼠红细胞SOD活性,心肌细胞膜Na - K - ATPase、Ca2 ATPase活性、心肌线粒体Ca2 含量,并能降低心肌线粒体内MDA含量、心肌组织Ca2 含量。在各给药组间无显著性差异。结论:1姜枣合用可维持细胞内钙稳态,具有一定的抗衰老作用;2自由基与钙超载协同作用可能是导致衰老的重要原因。     

甲状旁腺素对大鼠心肌细胞内游离钙和细胞凋亡的影响

目的　研究甲状旁腺素 (PTH)对心肌细胞内游离钙以及细胞肥大和凋亡的影响。方法　利用培养的新生大鼠心肌细胞 ,以Fluo 3/AM负载 ,通过激光共聚焦显微镜(LSCM)测定细胞内游离钙浓度 ([Ca2 + ] i) ;以细胞面积和细胞蛋白含量作为心肌细胞肥大指标 ;采用电镜和流式细胞术观察细胞凋亡的变化。结果　PTH1～ 34 0 0 1和 0 1 μmol·L- 1 刺激 7d后 ,心肌细胞内钙荧光强度以及心肌细胞面积和蛋白含量、细胞凋亡率较对照组显著增加。而 0 1 μmol·L- 1 PTH1～ 34 刺激的同时分别加入 1、1 0 μmol·L- 1 硝苯地平 ,上述指标改善 ,但未能达正常。结论　PTH1～ 34 可显著增加心肌细胞 [Ca2 + ] i,诱导细胞肥大和凋亡 ,并呈浓度依赖性 ,电压依赖性钙通道开放引起的细胞外钙内流增加为其机制之一     

极化心脏停搏液对离体成熟心肌细胞保护作用的研究

目的观察Na+通道阻滞剂河豚毒素(TTX)极化心脏停搏液对离体成熟大鼠心肌细胞内[Ca2+]i的影响,探讨其对成熟心肌细胞的保护作用。方法成年Wistar大鼠心脏,用酶解法分离成具有搏动性的单个成熟心室肌细胞悬液,随机分成基础组、STH2组和TTX组,STH2组和TTX组分别应用St.ThomasⅡ号停搏液和TTX停搏液处理,建立模拟缺血/再灌注损伤的停搏/复搏细胞模型,采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定各组细胞不同时期的[Ca2+]i。结果 TTX组和STH2组成熟心肌细胞复搏后[Ca2+]i均明显高于基础组,TTX组明显低于STH2组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论极化心脏停搏液较去极化心脏停搏液能减轻成熟心肌细胞Ca2+超载,对离体成熟心肌细胞有较好的保护作用。     

环孢素A对血管紧张素Ⅱ诱导的新生大鼠心肌细胞c-fos蛋白表达及Ca~(2+)变化的影响

环孢素A(CsA)是一种临床常用的免疫抑制剂,它通过特异性地抑制T细胞中的钙调神经磷酸酶(CaN),从而阻止IL-2等相应基因的转录表达.1998年Molkentin[1]发现CaN通路可能参与心肌肥大,研究CaN通路成了一大热点,本研究应用培养的新生大鼠心肌细胞,观察CsA对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的原癌基因c-fos蛋白表达和细胞内Ca2 水平([Ca2 ]i)的影响.     

极化心脏停搏液对离体成熟心肌细胞保护作用的研究

目的 观察Na+通道阻滞剂河豚毒素(TTX)极化心脏停搏液对离体成熟大鼠心肌细胞内[Ca2+]I的影响,探讨其对成熟心肌细胞的保护作用.方法 成年Wistar大鼠心脏,用酶解法分离成具有搏动性的单个成熟心室肌细胞悬液,随机分成基础组、STH2组和TTX组,STH2组和TTX组分别应用St.Thomas Ⅱ号停搏液和TTX停搏液处理,建立模拟缺血/再灌注损伤的停搏/复搏细胞模型,采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定各组细胞不同时期的[Ca2+]I.结果 TTX组和STH2组成熟心肌细胞复搏后[Ca2+]I均明显高于基础组,TTX组明显低于STH2组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 极化心脏停搏液较去极化心脏停搏液能减轻成熟心肌细胞Ca2+超载,对离体成熟心肌细胞有较好的保护作用.     

姜黄素对皮层神经元氧化损伤的保护作用

目的　观察姜黄素对第三丁基过氧化氢 (tert butylhy droperoxide,t BHP ,tBHP)诱导的大鼠皮层神经元氧化损伤的影响 ,探讨可能的机制。方法　培养胚胎鼠皮层神经元 ,MTT法测定细胞活力 ,DNA断裂评价细胞凋亡 ,流式细胞术测定线粒体膜电位和细胞内活性氧水平 ,分光光度法测定细胞内谷胱甘肽 (GSH)水平 ,Westernblot法测定Bcl 2和Bax蛋白和胞浆细胞色素C以及活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase 3)和多聚 (ADP 核糖 )聚合酶 [poly (ADP ribose)poly merase,PARP]水平。结果　姜黄素 (2 5～ 2 0 μmol·L-1)可有效减少tBHP对神经元的氧化损伤和tBHP引起的细胞内GSH水平降低 ,降低细胞内的活性氧水平 ,增加线粒体膜电位和细胞内GSH以及Bcl 2蛋白水平 ,减少线粒体内细胞色素C向胞浆释放和Bax蛋白表达水平 ,最终明显减少cas pase 3和PARP活化和tBHP引起的神经元凋亡。结论　姜黄素可减弱tBHP对原代皮层神经元的氧化损伤作用 ,其作用可能与降低细胞内的活性氧水平 ,保护线粒体功能有关