红花类黄酮生物合成通路2-ODD基因家族鉴定与表达分析

黄烷酮3-羟化酶(F3H)、黄酮醇合成酶(FLS)和花青素合成酶(ANS)是植物2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-ODD)超级家族中的成员,在植物类黄酮生物合成途径中起着重要的作用。本研究利用生物信息学的方法,从红花基因组数据库中共筛选鉴定16个类黄酮生物合成通路上的2-ODD基因,这些基因编码蛋白的长度为283(CtFLS2)～442 aa (CtANS6),分子质量为32 062.05 (CtFLS2)～48 245.49 Da (CtANS6),其编码蛋白均为亲水性蛋白。系统进化将其分为3个亚家族,保守基序分析发现该家族成员均含有H-x-D-xn-H和R-x-S两个保守残基,对上游2 000 bp区域顺式作用元件分析显示该家族基因受到光、温度等环境因素及水杨酸、茉莉酸甲酯等植物激素的调控,利用qRT-PCR技术揭示了红花类黄酮生物合成通路上的2-ODD家族基因成员在红花不同花期及叶片中的差异表达。本研究可为深入挖掘红花类黄酮生物合成途径上的2-ODD基因的功能奠定基础。     

基于巴戟天转录组数据的R2R3-MYB转录因子的鉴定和分析

为了挖掘参与巴戟天生长发育及次生代谢产物合成的MYB转录因子,本研究基于巴戟天根茎叶的转录组数据,筛选并鉴定巴戟天的R2R3-MYB转录因子,为以后通过遗传改良的手段调控巴戟天的代谢机制提供理论基础。根据巴戟天根茎叶的转录组数据,利用PFAM和plantTFDB等5个数据库,对预测的巴戟天R2R3-MYB转录因子进行鉴定, GO功能注释和分类、保守结构域分析、进化树比对分析和组织特异性表达差异分析。基于巴戟天的转录组数据共鉴定109个MYB转录因子,其中R2R3-MYB的数量为51个。亚细胞定位结果显示多数序列定位于细胞核,少部分位于细胞外基质。与分子功能、生物过程和细胞组分相关的GO terms的数量分别为112、76和239个。51个巴戟天R2R3-MYB转录因子中的R2-MYB和R3-MYB的保守基序分别为:-W-(X19)-W-(X19)-W-,-F-(X18)-W-(X18)-W-。通过与拟南芥R2R3-MYB转录因子的序列比对分析可知,除了S10、S19和S21亚家族没有分布,其他亚家族中都存在同源序列。RT-qPCR的结果验证了部分R2R3-MYB基因在3个组织差异性表达。获得的51个R2R3-MYB转录因子为进一步研究巴戟天MYB转录因子家族提供了一定的理论基础。     

响应ABA胁迫的甘草bZIP转录因子的系统筛选与分析

甘草为我国最常用的大宗药材之一,主要分布在干旱、半干旱区域,有着重要的经济和生态价值。bZIP转录因子在植物生物或非生物胁迫响应、生长发育、次生代谢产物合成等方面具有重要的调控作用。本研究利用Illumina高通量测序技术对不同浓度脱落酸(ABA)处理的甘草转录组进行测序,并基于已发表的甘草全基因组数据,以拟南芥基因组中发现的bZIP序列为参照,鉴定了甘草中的bZIP转录因子。之后筛选ABA依赖bZIP转录因子基因作为候选基因,对其编码蛋白理化性质、结构以及外源ABA胁迫下基因的表达模式进行分析。共鉴定到69个甘草bZIP转录因子家族基因,命名为GubZIP1-69,并根据它们与拟南芥bZIP的同源相似性分为A～I以及S这10个亚家族。通过计算69个GubZIPs基因在不同外源ABA胁迫下的相对表达量,筛选出可能参与ABA信号通路的调控基因,即GubZIP1、GubZIP5、GubZIP8、GubZIP30、GubZIP33和GubZIP56。外源ABA胁迫下候选GubZIPs基因的表达模式分析结果显示,与0 mg·L^-1浓度ABA处理下相比, 25 mg·L     

火麻仁基原植物bZIP基因家族鉴定及其调控油脂代谢的功能初探

bZIP (basic leucine zipper)基因家族是真核生物中最大的转录因子家族之一,其成员在逆境响应、次级代谢、植物生长、种子发育等方面发挥着重要作用。为探究火麻仁基原植物大麻(Cannabis sativa L.) bZIP (CsbZIP)基因的生物学功能,本研究基于大麻全基因组和转录组数据,利用生物信息学方法对CsbZIP基因家族进行系统性研究。结果表明,在大麻中鉴定到55个CsbZIP基因家族成员(CsbZIP1～CsbZIP55),分布在10条染色体上,属于12个亚家族,同一亚家族成员之间的基因结构和蛋白基序分布相似。片段重复是CsbZIP基因家族扩张的主要因素。顺式作用元件分析表明73个油脂合成基因的启动子区含有G-box或A-box元件, qRT-PCR实验表明7个CsbZIP基因和7个油脂合成基因在火麻仁中的相对表达量较高。相关性分析表明7个CsbZIP基因和7个油脂合成基因之间存在显著的正相关关系。本研究揭示了CsbZIP基因的结构特征、进化方式和表达模式,为进一步研究CsbZIP基因对火麻仁油脂代谢的调控提供了重要线索。     

地黄全长转录组测序及苯乙醇苷合成途径催化酶基因鉴定

地黄为玄参科药用植物,具有重要的药用价值。为了有效发掘地黄的转录组信息,鉴定参与苯乙醇苷(PhGs)类成分生物合成的催化酶基因,本研究以地黄的叶、茎和块根为材料利用Pacific Biosiences RS Ⅱ平台进行测序。共获得非冗余的转录本27 773条,平均长度2 380 bp,预测出27 236个蛋白编码序列(CDS:coding sequence)。利用BLAST等软件在NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro等数据库共预测到27 399个注释的基因。NR注释表明,与地黄转录本匹配数量最多的是芝麻(Sesamum indicum),有81.44%,这与它们进化上的亲缘关系一致。推测了参与异毛蕊花糖苷、松果菊苷、肉苁蓉苷A、肉苁蓉苷F、2′-乙酰毛蕊花糖苷和leonoside F生物合成的催化酶,并鉴定出143个参与苯乙醇苷类成分生物合成的转录本。19个催化酶基因在地黄12个组织中与毛蕊花糖苷的含量呈正相关,其中多数基因在叶和花中具有较高的表达量。研究结果为地黄功能基因的挖掘提供了可靠的转录组数据,为苯乙醇苷类成分生物合成的分子机制研究提供了依据...     

基于全长转录组测序的掌叶大黄R1-MYB基因家族鉴定分析

作为MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子家族的一大类, R1-MYB (MYBrelated)家族在植物生长发育、环境胁迫及激素信号转导等方面发挥重要的调节作用。本研究基于全长转录组测序分析,系统筛选掌叶大黄R1-MYB家族基因,分析其编码蛋白的理化、结构域及分子进化等特性,利用RNA-seq进行基因组织表达分析,并检测RpMYB24响应激素、非生物胁迫的表达模式。结果表明,共鉴定到掌叶大黄49个R1-MYB家族基因,主要编码热稳定的亲水蛋白,大部分定位于细胞核。各蛋白无规卷曲和α螺旋所占比例较大,存在MYB家族标志性的W型保守氨基酸。掌叶大黄R1-MYB家族成员分布于CCA1 (circadian clock associated 1)-like、I-box (GATAAG)-like、CPC (CAPRICE)-like、TRF (telomere repeat binding factor)-like和TBP (TATA binding protein)-like 5个亚组,且CCA1-like数量...     

基于高通量测序454 GS FLX的丹参转录组学研究

本研究应用新一代高通量测序技术454 GS FLX Titanium对2年生丹参根的转录组进行测序, 研究其基因表达谱, 挖掘其功能基因。获得46 722表达序列标签 (express sequence tags, EST), 序列平均长度414 bp, 与Sanger测序的长度相当。所得序列与GenBank丹参EST合并拼接, 获得18 235条unigene, 其中, 454高通量测序发现了13 980条新的unigene。数据库中的序列同源性比较表明, 其中73.0% (13 308条) 与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。通过BLAST与Gene Ontology分析获得了可能参与丹参酮合成的序列27条 (编码15个关键酶), 参与丹酚酸合成的序列29条 (编码11个关键酶), 细胞色素P450序列70条, 转录因子序列577条。454高通量测序技术作为药用植物功能基因组研究的重要手段可在丹参功能基因的发现中发挥重要作用, 这些基因的发现为丹参酮和丹酚酸类化合物生物合成研究奠定了基础, 同时也为丹参的转录组研究提供了基础数据。     

掌叶大黄转录因子RpMYB4基因克隆及分子表达特性

MYB转录因子在植物生长发育、次生代谢及逆境胁迫等过程中发挥重要的转录调控作用.本实验在掌叶大黄转录组数据库中筛选一个包含完整开放阅读框(ORF)的MYB家族成员序列,首次克隆获得RpMYB4基因ORF,编码一条245个氨基酸的多肽,分子质量为26.99 kDa,N端含有R2R3-MYB亚家族典型的2个DNA保守结合域...     

基于454FLX高通量技术的厚朴叶绿体全基因组测序及应用研究

 叶绿体基因组序列在中药DNA条形码鉴定及基因工程生物制药方面具有广泛的应用前景。本文应用454高通量测序技术对厚朴进行了叶绿体全基因组测序, 建立了标准测序流程。生物信息学分析共获得有效序列重叠群 (contig) 14个, 测序覆盖度达到99.99%。厚朴叶绿体基因组大小为160 183 bp, 大 (LSC)、小 (SSC) 单拷贝区大小分别为88 210 bp和18 843 bp, 反向互补重复区 (IR) 大小为26 565 bp, 共注释叶绿体基因126个, 其中每个IR区17个。厚朴与木兰亚纲其他物种的叶绿体编码基因在种类、排列顺序及结构大小上基本一致。采用叶绿体81个蛋白编码基因对厚朴及同属5个种9个样本进行了分子鉴定, 鉴定效率100%, 并且可以成功区分不同产地的凹叶厚朴。以上结果表明, 本研究建立的标准测序流程适用于叶绿体基因组测序, 叶绿体基因组序列可有效区分厚朴及近缘物种。     

中药火麻仁基原植物Hsp20基因家族鉴定及表达分析

Hsp20 (heat shock protein 20)基因家族在植物生长发育和胁迫响应中发挥着重要的作用。为探究大麻(Cannabis sativa L.) Hsp20 (CsHsp20)基因的功能,本研究在全基因组和转录组水平上采用生物信息学手段对CsHsp20基因家族进行系统性研究。结果表明,在大麻中鉴定到35个CsHsp20基因家族成员(CsHsp20-1～CsHsp20-35),分布在9条染色体上,属于10个亚家族,同一亚家族成员之间蛋白基序分布相似。多种激素和胁迫响应顺式作用元件存在于CsHsp20基因的启动子区,表明其可参与植物的生长发育和多种胁迫响应。蛋白互作分析表明CsHsp20蛋白与Hsp家族其他成员之间存在互作关系且受转录因子Hop和HSFA2的调控。转录组数据表明在大麻的不同组织器官及不同发育时期中CsHsp20基因家族成员表达水平存在差异,主要在火麻仁及其成熟期高表达,表明CsHsp20家族成员可调控火麻仁的生长发育。本研究为CsHsp20基因家族功能研究和火麻仁基原植物的定向培育奠定了基础。     

靶向MMP-2基因的RNA干扰质粒表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶2(MMP-2)特异的RNA干扰(RNAi)质粒载体,用于探讨抑制MMP-2基因表达在抗胰腺癌侵袭转移中的意义.方法 根据GenBank中提供的MMP-2基因序列,设计能存体内转录小发央结构RNA(shRNA)的cDNA序列,合成该序列并将其连接到pGCsi-U6/Neo/GFP质粒,构建受控于人U6启动子的质粒表达载体.结果 PCR鉴定和测序鉴定显示构建的重组质粒pGCsi-MMP-2含有目的 基因序列.结论 靶向MMP-2基因的RNAi质粒表达载体被成功构建.     

利用转录组学数据研究健康人骨髓红系细胞基因表达的差异

目的 分析骨髓红系细胞的转录组数据,筛选出差异表达基因并对功能基因进行挖掘和分析,以期为红细胞成熟分化的分子机制提供理论依据.方法 从TCGA数据库下载骨髓红系细胞转录组测序数据,对测序数据进行de novo拼接和功能注释;筛选出差异表达基因及在COG、GO、KEGG数据库中进行比对注释;基于Swiss-Prot功能注...     

西洋参PqERF1基因的克隆和生物信息学分析

乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是具有PETALA2(AP2)结构域的转录因子。本研究通过西洋参(Panax quinquefolius L)的转录组高通量测序结果分析获得75条具有AP2结构域的转录因子序列,并克隆到一条开放阅读框为933对碱基的基因序列,定名为PqERF1。基因表达分析结果表明PqERF1基因受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,这与人参皂苷含量的受诱导模式相同。蛋白结构预测结果表明PqERF1是定位于细胞核的具有完整保守的AP2结构域的转录因子,InterproScan蛋白功能结构域分析结果表明PqERF1很可能为发病机制相关蛋白;序列比对和进化关系分析结果也显示PqERF1与发病机制相关蛋白(烟草NtERF4)、次生代谢产物相关合成蛋白(野胡萝卜DcERF1)和花衰老相关蛋白(矮牵牛PhERF12)的相似性高,且系统进化关系较近。因此,推测PqERF1基因可能是参与西洋参次生代谢产物合成调节、抗病性和衰老相关的重要基因。     

三七PnMYB1R1基因的克隆、亚细胞定位与不同胁迫下的表达分析

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物信号转导、生长发育和植物防御反应中起到重要作用。本研究以三七(Panax notoginseng)为材料,设计特异引物,克隆了三七中1R-MYB转录因子PnMYB1R1基因,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、亚细胞定位、转录活性分析、组织特异性分析及非生物胁迫下的诱导表达分析。PnMYB1R1基因开放阅读框(ORF)长738 bp,编码245个氨基酸,蛋白分子质量27.0 kD。序列分析及系统进化树结果表明PnMYB1R1包含1个保守的R3结构域,属于1R-MYB型转录因子中的TRF-like类蛋白。构建原核表达载体pET28a-PnMYB1R1并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达PnMYB1R1重组蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。亚细胞定位实验结果表明PnMYB1R1定位于植物细胞的细胞核中。转录活性分析显示PnMYB1R1转录因子具有转录激活活性。实时荧光定量PCR结果表明PnMYB1R1基因在三七主根中表达量最高,茎、叶次之,须根中表达量最低。盐、低温及干旱胁迫均能够影响主根、须根、茎、叶中PnMYB1R1基因的表达...     

三七PnUGT1基因的全长cDNA克隆和生物信息学分析

本研究通过对三七的转录组高通量测序结果进行分析,采用5’-RACE和RT-PCR方法,对其中一条可能参与三萜皂苷合成的UDP-糖基转移酶基因转录本(Pn02086)进行全长克隆,预测了该基因编码蛋白的理化性质、保守结构域等,并对其进行了进化分析。通过全长克隆,得到一条开放阅读框为1 488 bp的cDNA序列,命名为PnUGT1,GenBank登录号JX018210。该基因编码495个氨基酸,蛋白分子量为55.453 kD,属于不稳定蛋白。二级结构中α-螺旋占36.16%、β-折叠占11.31%、无规卷曲占52.53%。InterProScan预测该蛋白具有7个保守结构域,包括在植物次生代谢产物中相关糖基转移酶特有的PSPG保守基序。该蛋白不具有信号肽和跨膜区,最有可能定位在细胞质中。序列比对和进化关系分析表明,该蛋白和蒺藜苜蓿三萜合成相关的UDP-糖基转移酶AAW56092的亲缘关系较近,PSPG保守区域的相似性为66%。该基因在三七叶中表达量较在花、茎和根中的表达量高。推测PnUGT1基因可能参与了三七皂苷的合成。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

中药火麻仁基原植物大麻MIKC型MADS-box基因家族鉴定与表达分析

MIKC型MADS-box基因家族在植物花发育中发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法从基因组数据中对大麻(Cannabis sativa L.) MIKC型基因进行鉴定,并对基因序列特征、染色体定位、基因结构、系统发育树和组织表达模式等进行分析。结果表明,共鉴定出39个CsMADS基因,不均匀分布在9条染色体上,编码的氨基酸数目介于146～503,等电点为5.19～10.12,分子质量为16 739.35～57 070.56 Da;亚细胞定位预测显示CsMADS基因均定位在细胞核里;保守结构域表明CsMADS基因均含有MADS保守结构域; GO功能注释分类共注释到331个GO terms,主要集中在分子功能中,共聚类178个;系统进化树显示CsMADS基因分为14个亚类,按照ABCDE同源异型基因模型分类,能够分别与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中SQUA/AP1、AP3、PI、GGM13、AG、SEP/AGL2等类亚家族聚成一类; CsMADS基因上游启动子区具有丰富的顺式作用元件,其中主要为光调控元件;实时荧光定量PCR验证了部分CsMADS在花和苞片中相对表...     

决明GSK基因家族全基因组鉴定及其表达分析

糖原合成激酶3 (glycogen synthase kinase 3/SHAGGY-like kinase, GSK3)在调节植物生长发育和胁迫响应方面发挥重要作用。为揭示药用植物决明(Senna tora L.) GSK家族成员特性,本研究基于其全基因组数据,结合生物信息学及基因表达研究方法,开展决明GSKs基因鉴定及表达分析。共鉴定到9个StoSKs基因家族成员,均具有GSK特征激酶结构域, 9个成员分布在6条染色体上,编码氨基酸长度为465～943 aa,蛋白分子质量介于33.57～88.83 kDa,平均等电点为8.2。StoSKs基因家族分为4个进化分支,同一进化分支中的StoSKs之间具有相同的外显子/内含子结构及保守基序。StoSKs家族成员扩张主要源于片段重复事件,与大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)分别存在17、11、8和7对共线基因对。StoSKs启动子区域多含有与胁迫刺激、生长发育、激素诱导相关的响应元件。转录组数据分析发现StoSKs...     

钩藤STR基因及其启动子的克隆与分析

根据钩藤转录组中STR基因核心序列设计特异性引物,并进行RACE扩增,克隆到UrSTR基因(GeneBank:OL310251)的cDNA全长1 541 bp,编码345个氨基酸;采用染色体步移克隆到UrSTR基因启动子(GeneBank:OL310252)序列1 179 bp。系统进化发育树分析显示,钩藤UrSTR蛋白与同为茜草科的美丽帽柱木和短小蛇根草的STR蛋白聚为一类,其亲缘关系最近;亚细胞共定位实验表明UrSTR蛋白定位于液泡膜上;SDS-PAGE结果表明pET-28a-UrSTR重组蛋白成功表达且大小与预期相符;启动子顺式作用元件分析表明其含有光响应、胁迫响应和激素响应有关的多种调控元件;启动子活性分析UrSTR基因启动子具有转录活性。成功克隆了UrSTR基因及其启动子序列并对其进行生物信息学分析和启动子活性分析;后期需要优化UrSTR原核表达体系,为进一步纯化UrSTR蛋白研究其结构和功能奠定基础。