重组人甲状旁腺激素1-34的纯化研究

重组人甲状旁腺激素(rhPTH(1-34))在工程菌pET(32a+)-PTH(1-34)/BL21(DE3)中以胞内可溶性融合蛋白形式高效表达。经过高压匀浆破菌处理,取上清经过亲和层析、酶切、阴离子交换层析、反相层析和阳离子交换层析进行分离纯化,得到rhPTH(1-34)原液样品纯度在98%以上,比活性达到1.05×104U/mg。     

重组人甲状旁腺激素1-34的氨基酸组成分析

分析重组人甲状旁腺激素 1-3 4的氨基酸组成 ,为该品种的结构鉴定提供依据。水解条件含 1%苯酚的6mol L盐酸 ,10 5℃水解 2 4h ;衍生方法异硫氰酸苯酯 (PITC)柱前衍生法 ;氨基酸测定色谱条件色谱柱为PhenomenexprodigyODS 10 0A。 (4 .6mm× 2 5cm ,5 μm) ;流动相A为 0 .1mol L醋酸钠 (pH6.5 ) -乙腈 (93 :7) ,B为水 -乙腈 (1:4) ;二元梯度洗脱 ;检测波长为 2 5 4nm ;流速为 1ml min ;柱温为 40℃。结果 :实验值与理论值一致 ,偏差小于 10 %。本法准确、可靠、重现性好 ,可用于该产品的质量控制。     

人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的设计与活性验证

通过对NCBI数据库中不同物种同源序列进行比对protein-protein BLAST,并利用计算机软件DiscoveryStudio3.1进行分子对接和分子动力学模拟,对天然人甲状旁腺激素(1 34)的3个氨基酸R25K26K27进行Q25E26L27置换,并对突变体的生物活性进行了评价。结果显示:突变后PTH(1 34)-(RKK-QEL)和突变前PTH(1 34)多肽主链叠合后均方根偏差RMSD值为2.509 3,说明两者主链结构构象差异不大;PTH(1 34)-(RKK-QEL)与受体蛋白PTH1R的相互作用能为599.253 kcal.mol 1,较天然PTH(1 34)的554.083 kcal.mol 1增强7.5%;氢键数目由32对增加至38对;PTH(1 34)-(RKK-QEL)能显著刺激UAMS-32P细胞RANKL基因的表达(P<0.01),并抑制OPG基因的表达(P<0.01);PTH(1 34)-(RKK-QEL)作用于UAMS-32P和小鼠原代股骨骨髓细胞共培养体系时,能显著刺激破骨细胞的形成(P<0.01),并且活性高于PTH(1 34)标准品。     

重组人甲状旁腺激素1-34多次皮下注射给药的人体药动学特征

目的研究健康志愿者多次皮下注射重组人甲状旁腺激素1-34[(rhPTH(1-34)]后体内的药动学特征。方法8名健康志愿者多次皮下注射rhPTH(1-34)后,采用放射免疫法测定血浆中rhPTH(1-34)浓度,评估它的药动学特性。结果rhPTH(1-34)的主要药动学参数如下:d 1,AUC0→t为(17103.3±2243.3)ng.min.L-1,AUC0→∞为(20471.3±2444.6)ng.min.L-1,ρmax为(171.2±34.2)ng.L-1,tmax为(38.1±15.1)min,t12为(55.7±3.9)min;d 7,AUC0→t为(17759.6±3781.5)ng.min.L-1,AUC0→∞为(20698.4±3374.6)ng.min.L-1,ρmax为(184.6±36.8)ng.L-1,tmax为(35.0±16.0)min,t12为(51.6±7.6)min,蓄积系数R为1.02±0.18。结论多次皮下注射rhPTH(1-34)后,与单次给药相比它在人体内的吸收、消除不随连续给药变化,药物在体内没有蓄积作用。rhPTH(1-34)的安全耐受性良好。性别对药动学参数没有影响。     

重组人甲状旁腺激素（1—34）在体外对UMR106细胞增殖、分化功能的影响

目的:观察重组人甲状旁腺激素(1-34)[recombinant human parathyroid hormone(1-34),rhPTH(1-34)]对成骨样细胞 UMR106细胞增殖、分化功能的影响,初步探讨其作用机理。方法:采用体外培养的 UMR106细胞,在连续或间歇2种给药方式下,以1×10~(-12)～1×10~(-7)mol·L~(-1)rhPTH(1-34)作用于细胞,选择 MTT 法考察 rhPTH(1-34)对成骨细胞分裂和增殖的影响,同时测定细胞裂解液中代表成骨细胞分化功能的碱性磷酸酶活性。结果:rhPTH(1-34)连续作用于 UMR106细胞时,能抑制增殖和分化,且浓度越高,抑制作用越强;间歇作用于 UMR106细胞时,能够促进细胞的增殖和碱性磷酸酶活性的升高,并且浓度为1×10~(-10)mol·L~(-1)时,促进作用最强,而高于或低于该浓度,作用减弱。结论:rhPTH(1-34)对 UMR106细胞增殖和分化功能的影响与给药方式和药物浓度有关。连续给药时,抑制 UMR106成骨样细胞的增殖和分化,浓度越高,抑制作用越强;而间歇给药时,促进成骨样细胞的增殖和分化,其剂量反应曲线呈类似钟形曲线。     

注射用重组人甲状旁腺素(1-34)在健康人体的药代动力学

目的研究注射用重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)](激素)在中国健康人体内的药代动力学特征。方法30名健康受试者随机分为10,20,40μg3个剂量组,每组10人,用免疫放射测定法(IRMA)测定人血浆中甲状旁腺激素(PTH)浓度。结果药代动力学参数:tmax分别为(32.5±9.5),(24.0±9.7)和(35.0±13.5)min;Cmax分别为(0.14±0.04),(0.20±0.05)和(0.30±0.04)ng.mL-1;t1/2分别为(47.7±12.1),(50.1±16.4)和(53.6±14.4)min;AUC(0-240)分别为(9.79±1.46),(15.42±1.66)和(32.72±3.16)ng.min.mL-1。结论单次皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)在低、中、高3个剂量内,Cmax和AUC呈线性增长,与剂量呈正相关;体内代谢呈线性代谢特征,与国外报道基本一致。     

HPLC法测定甲状旁腺激素(1-34)原料药的含量

目的:建立以高效液相色谱法测定甲状旁腺激素(1-34)原料药含量的方法。方法:色谱柱为Spherisorb ODS;流动相A为甲醇,流动相B为0.05mo·lL-1 Na2SO4水溶液(磷酸调节至pH2.5),A∶B=30∶70;流速为1.0mL·min-1;检测波长为215nm;柱温为室温;进样量为20μL。结果:甲状旁腺激素(1-34)检测浓度线性范围为0.06～0.90mg·mL-1(r=0.99997),平均回收率98.6%,RSD=0.15%。结论:本方法简便、准确、灵敏度高,可用于甲状旁腺激素(1-34)原料药含量的测定。     

重组人甲状旁腺激素(1-34)片段促进动物骨折愈合的研究

目的：通过实验动物骨折模型观察重组人甲状旁腺激素（1-34）片段[rhPTH（1-34）]促进动物骨折愈合作用，并初步探讨rhPTH（1-34）的作用机制。方法：制备日本大耳自家兔标准骨折模型，随机分为对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，高、中、低剂量组皮下间歇注射不同剂量的rhPTH（1-34）。检测血清骨特异性碱性磷酸酶（bAKP）、骨保护素（OPG）、骨钙素（BGP）、白介素-6（IL-6）指标，同时进行病理组织形态学及骨组织形态计量学观察。结果：X线片和组织学结果显示，与对照组相比，rhPTH（1-34）各组骨折愈合速度加快，骨形成活跃。rhPTH（1-34）各组在术后1周后，血清bAKP均明显升高（P〈0．05）。随后高剂量组bAKP仍呈上升趋势，其余各组随骨折愈合而逐渐下降至正常水平。除低剂量组外，其他实验各组血清OPG水平在2周达到最高值，随后除高剂量组外，也相对维持在高的水平。实验各组术后IL-6水平均比术前有一定程度的升高，术后4周对照组升高尤为显著。结论：rhPTH（1-34）可以促进兔骨折早期愈合，促进骨形成并且可抑制骨吸收。     

注射用重组人甲状旁腺素（1-34）的Ⅰ期临床耐受性研究

目的：评价中国健康志愿者皮下注射重组人甲状旁腺素（1—34）的安全性和耐受性。方法：将40例18～40岁的健康受试者随机分为10，20和40μg3个剂量组，腹部皮下注射，观察临床症状体征并严密观察记录试验期间发生的不良反应事件。结果：各组受试者体检及实验室检查各项指标均在正常范围，具较好的可比性。给药后生命体征和实验室检查均未见有临床意义的改变，试验中未见严重不良反应发生。结论：健康受试者皮下注射甲状旁腺素（1-34）40μg以内安全性和耐受性较好。     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

人甲状旁腺素(1-34)的合成与聚乙二醇化修饰

目的合成人甲状旁腺素(1 34) [hPTH(1-34) ]并进行聚乙二醇化修饰。方法应用固相多肽合成方法合成并经高效液相色谱纯化得hPTH(1-34) ,Cys-hPTH(1- 34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 。Cys hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 在水溶液(pH 7～8)中分别与平均相对分子质量为5 0 0 0的单甲氧基马来酰亚胺基聚乙二醇(mPEG50 0 0 MAL)反应,经高效液相色谱纯化得Cys(mPEG50 0 0 MAL)- hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys(mPEG50 0 0- MAL) -NH2 。结果hPTH(1-34) ,Cys(mPEG50 0 0 MAL) hPTH(1 34)和hPTH(1 34) Cys(mPEG50 0 0 MAL) NH2 的质谱和氨基酸组成分析结果均与理论值一致。hPTH(1-34) -Cys(mPEG50 0 0-MAL) NH2 保持了较好的体外活性,Cys(mPEG50 0 0- MAL) hPTH(1-34)保持了较好的体内活性。结论采用一种简便的方法成功实现了对hPTH(1-34)的N端或C端的聚乙二醇化修饰     

人甲状旁腺素(1-34)对新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性影响

目的：研究外源性hPTH(1-34)对原代培养成骨细胞ALP活性影响。方法：新生大鼠头盖骨中取成骨细胞,改良Gomori氏钙钴法染色鉴定,磷酸苯二钠法测定ALP活性,RT-PCR检测ALP mRNA表达。结果：10^-8 mol.L^-1 hPTH(1-34)以48 h为一循环,在每一循环的前12 h作用于细胞时,可使成骨细胞ALP活性较对照组增加最明显,hPTH(1-34) 48 h作用组,与对照相比细胞ALP活性无显著差异。hPTH(1-34) 12 h作用组,成骨细胞ALP mRNA表达最高。结论：hPTH(1-34)刺激成骨细胞内ALP活性升高与给药方式及药物浓度有关,间歇性给药成骨细胞内ALP活性升高。     

重组人甲状旁腺素1-34联合钙尔奇D治疗绝经后女性骨质疏松疗效观察

目的 研究重组人甲状旁腺素1-34(recombinant human parathyroid hormone 1-34,rhPTH1-34)联合钙尔奇D治疗绝经后妇女骨质疏松的治疗效果.方法 84例绝经后骨质疏松妇女被随机分为实验组和对照组,每组均有患者42例.实验组采用rhPTH1 34)联合钙尔奇D治疗,对照组仅采用钙尔奇D治疗,疗程均为6个月.观察两组患者治疗前后骨密度变化、血清钙、磷和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、骨痛症状变化和治疗期间的骨折发生率.结果实验组治疗后的骨密度(T值)较治疗前增加,差异具有统计学意义(P<0.05);并且实验组治疗后的骨密度(T值)较对照组治疗后的骨密度(T值)增加,差异具有统计学意义(P<0.05).实验组和对照组治疗后ALP的浓度均高于治疗前,差异具有统计学意义(P<0.05),并且实验组治疗后ALP的浓度高于对照组治疗后,差异具有统计学意义(P<0.05).实验组的骨痛治疗有效率为66.67%;对照组为50%,实验组的有效率高于对照组,差异具有统计学意义(χ2=4.04,P<0.05).结论 rhPTH1 34联合钙尔奇D能够有效的提高绝经后女性的骨密度,减少骨质疏松的症状.     

重组人甲状旁腺素1-34分子量测定方法的研究

分别采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)、Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Tricine-SDS-PAGE)和分子排阻色谱法(SEC)测定重组人甲状旁腺素1-34的相对分子质量,为制定该品种的质量标准提供依据。MALDI-TOF/MS测定基质溶液为α-氰基-4-羟基肉桂酸(a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid,CCA);Tricine-SDS-PAGE电泳采用Tris-tricine电极缓冲系统;SEC测定色谱柱为TSK-GELG2 000 SWXL(300mm×7.8mm,5μm);流动相为三氟乙酸-乙腈-水(0.05∶20∶80);检测波长为215nm;流速为0.5 mL.min-1。结果:质谱法测定结果准确,实验值与理论值一致,误差±1;Tricine-SDS-PAGE测定结果与理论值基本一致,误差小于10%;但SEC法测定结果与理论值偏差较大。质谱法适用于产品的质量控制。     

重组人甲状旁腺素1～34肽的组织分布和排泄研究

研究重组人甲状旁腺素1~34肽(recombinant human parathyroid hormone1~34,rhPTH1~34)在小鼠中的组织分布和在大鼠中的排泄,为国产rhPTH1~34申报临床研究提供实验依据。用Iodogen法将放射性同位素125I标记到rhPTH1~34的酪氨酸残基上,通过同位素示踪和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)相结合的方法考察皮下给药后,125I-rhPTH1~34在小鼠中的组织分布和在大鼠中的排泄。大鼠皮下给予125I-rhPTH后,125I-rhPTH主要从尿中排出,48 h内通过尿液排出(80.33±3.92)%的放射性活性,而相同时间内通过胆汁和粪便排出的放射性活性仅为(7.12±1.52)%和(2.55±1.28)%。RP-HPLC分离结果表明在0~2 h,2~4 h和4~8 h收集的尿液中有125I-rhPTH1~34原型存在,其含量分别相当于该时段通过尿排出的放射性活性的33.62%,17.23%和16.05%;在胆汁和粪便中没有检测到125I-rhPTH1~34原型。小鼠皮下注射给予125I-rhPTH1~34后,rhPTH1-34主要分布在肾脏,并在给药后25 min达到峰值,此后随着时间的延长其在肾脏中的相对积累系数不断下降;与肾脏不同,rhPTH1-34分布到其他组织中的速度较慢,在给药后120 min相对积累系数才达到峰值;此时rhPTH1~34在各组织中的相对累积系数的的大小为:肾>胃>脾>肺>肌肉>肠>心>肝>骨>脑。rhPTH1~34主要在肾脏代谢并以原形和代谢物的形式通过尿液排出体外。     

注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的测定及其药动学

目的:注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)在体内的代谢产物PTH(1-34)对骨质疏松症具有较好的疗效,本试验通过测定人血浆中PTH(1-34)浓度的变化,了解PTH(1-34)在体内的分布,对注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)的药效及作用机制具有重要意义。方法:采用固相萃取法结合放射免疫分析(RIA)测定人血浆中注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的浓度,采用DAS2.0数据处理系统进行药动学分析。结果:PTH(1-34)的线性范围为10～1 280 pg.mL-1,最低检测限为10 pg.mL-1(RSD为3.51%),采用固相萃取柱Styre Screen H2P在血浆样本萃取效率大于85%。结论:本法测定注射用重组人甲状旁腺素在血浆中的代谢产物PTH(1-34)的方法是可行的,特异性、灵敏度、精密度和准确度较高,可应用于临床样本的检测。     

重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症的研究进展

本文就重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症的研究概况作一综述,重点介绍重组人甲状旁腺素(1- 34)和重组人甲状旁腺素(1-84)的药理毒理和临床研究工作,为研究和开发甲状旁腺素提供参考。     

重组人甲状旁腺素(1-34)对绝经后骨质疏松患者血基质金属蛋白酶1及其组织抑制因子的影响

目的观察重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)]对绝经后骨质疏松患者血清基质金属蛋白酶1(MMP-1)及其组织抑制因子(TIMP-1)水平的影响,探讨其调节骨代谢的机制。方法绝经后女性90名分为骨质疏松组和正常组,骨质疏松组每日皮下注射rhPTH(1-34)20μg+钙剂600 mg+维生素D_3 200 IU,正常组不给予任何药物干预。检测腰椎骨密度(BMD),血钙、磷、MMP-1、TIMP-1、内源性全段甲状旁腺素(iPTH)、骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)以及尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(NTX)水平,并分析参数之间的相关关系。结果正常组BMD、血钙高于骨质疏松组(p<0.01),而iPTH、BSAP、MMP-1和尿NTX低于骨质疏松组(P<0.05)。rhPTH(1-34)治疗后,骨质疏松组患者腰椎BMD,血钙、磷、MMP-1、BSAP和尿NTX增高,而iPTH下降,与治疗前相比差异显著(P<0.05)。血TIMP-1与腰椎BMD成负相关(r=-0.376,P=0.014),校正年龄、体重指数后关系仍然存在;MMP-1与其他指标没有相关性。结论小剂量rhPTH(1-34)可促进绝经后骨质疏松患者血MMP-1水平增高,从而使成骨活性增强,这可能是其促进骨形成的机制之一。     

HPLC法测定甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量

目的:建立测定甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18,流动相为0.05mo·lL-1氯化钾水溶液(磷酸调节pH至4.5)-乙腈=75∶25,流速为1.0mL·min-1,检测波长为210nm,柱温为室温,进样量为20μL;以主成分自身对照法计算有关物质的含量。结果:甲状旁腺激素1-34与杂质能完全分离,其有关物质检测浓度线性范围为5～50μg·mL-1(r=0.99996);3批样品中有关物质含量均小于0.29%。结论:所建立的方法简便、准确、灵敏度高、专属性强,可用于甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量测定。     

rhPTH（1-34）对大鼠类固醇性骨质疏松治疗作用研究

目的：观察重组人甲状旁腺激素rhPTH（1-34）对大鼠类固醇性骨质疏松的治疗作用。方法：应用皮下注射醋酸泼尼松龙注射液的方法建立类固醇性骨质疏松模型。给予皮下注射5、10、20μg·kg^-1·d^-1 rhPTH（1-34）治疗12w。观察骨组织形态,计量骨密度、骨生物力学和骨代谢相关的血尿生化指标,综合评价rhPTH（1-34）对大鼠类固醇性骨质疏松的治疗效果。结果：皮下注射醋酸泼尼松龙注射液,骨体积和成骨表面显著下降,骨吸收表面显著升高,表明形成了类固醇骨质疏松。不同剂量的rhPTH（1-34）对大鼠股骨骨密度（BMD）均有显著增加。在股骨生物力学特征方面,rhPTH（1-34）中、高剂量组的最大位移（du）显著升高,高剂量组的衰竭功（U）升高;在股骨骨形态计量学方面,不同剂量的rhPTH（1-34）对骨体积均显著升高,矿化沉积率均显著升高,肋骨宽度（O.Th）均显著下降,骨重建时间（δ）均显著缩短等;在血清和尿生化指标方面,不同剂量的rhPTH（1-34）对骨钙素（BGP）均显著升高,尿羟脯氨酸/肌苷均显著下降,中、高剂量组对尿Ca显著下降。结论：rhPTH（1-34）对大鼠类固醇性骨质疏松具有显著的治疗作用。