体外培养角膜内皮移植的研究进展

随着角膜内皮细胞体外培养扩增技术不断完善，以及近年后（深）板层角膜内皮移植技术的兴起，以各种载体进行培养角膜内皮细胞进行后板层移植，以代替穿透性角膜移植的研究具有广阔的应用前景。本文就角膜内皮细胞的培养、移植载体的选择和移植技术的发展加以综述，并对目前仍需解决的问题及其前景进行展望。     

角膜内皮细胞体外培养的研究进展

随着角膜内皮细胞体外培养扩增技术的发展,以及后板层角膜内皮移植技术的兴起,以各种载体培养角膜内皮细胞进行后板层角膜移植替代穿透性角膜移植的研究,受到学者们的关注.角膜内皮细胞体外培养的成功受多种因素影响,本文就角膜内皮细胞体外培养载体的选择及其生长刺激因素作一综述.     

羊膜载体培养标记兔角膜内皮细胞移植的研究

目的探讨以羊膜基底膜为载体培养兔角膜内皮细胞移植的可能性,为培养内皮细胞移植治疗角膜内皮失代偿疾病提供依据与方法。方法体外培养扩增兔角膜内皮细胞,采用亲脂性碳青染料(CM-DiI)对细胞进行标记,种植于去除上皮细胞的羊膜基底膜上,体外培养形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学、超微结构及细胞标记情况的观察;将羊膜为载体培养的内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植和单纯角膜后板层切除为对照,术后观察角膜透明度与厚度,对其进行组织学与细胞标记情况的检测。结果 5～7d 角膜内皮细胞即在羊膜基底膜上融合成单层,细胞为扁平多角形,排列紧密,密度可达(3202.84±347.77)个/mm~2,荧光显微镜下可见内皮细胞被 CM-DiI 标记后显现红色荧光;培养内皮层移植后角膜维持相对的透明与薄度,而无内皮细胞羊膜移植和单纯后板层切除两组对照角膜严重水肿、混浊,厚度明显超过实验组角膜;培养内皮移植后角膜形成新的内皮层,通过标记的细胞发现移植后细胞仍为培养移植的内皮细胞而非周边细胞的移行。结论羊膜基底膜是角膜内皮细胞生长和移植的良好载体,体外培养角膜内皮细胞移植有望代替供体角膜移植,具有广阔的应用前景。(中华眼科杂志,2006,42:925-929)     

人脐静脉内皮细胞移植治疗角膜内皮功能衰竭的动物实验研究

目的：探讨异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行后板层角膜移植（PLEK）治疗角膜内皮衰竭的可行性。方法：新西兰白兔30只,随机分为3组,实验组、基质组和对照组,每组10只,术中去除角膜内皮细胞,建立角膜内皮衰竭动物模型,实验组和基质组行后板层角膜移植术,对照组仅去除角膜后板层组织,不进行移植。术后观察3mo,对三组角膜的水肿混浊程度和中央角膜厚度进行统计学分析。结果：术后7d,实验组角膜水肿程度较基质组和对照组明显减轻,透明度增加。术后3mo时,实验组内皮细胞密度为2 026.4±129.3个/mm2,中央角膜厚度平均为505.2±25.4μm,基质组中央角膜厚度平均为1 535.6±114.5μm,而对照组为1 493.5±70.2μm。结论：实验以异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞,行后板层角膜移植术,治疗角膜内皮衰竭取得了初步成功。移植的人脐静脉内皮细胞能够在活体上成活,并具有一定的角膜内皮细胞的生物学功能,维持角膜透明,为临床上治疗角膜内皮疾病提供了新的思路和方法。     

组织工程角膜研究和应用进展

中国角膜供体材料的严重缺乏导致众多的角膜盲患者不能通过角膜移植来复明仍是临床棘手的问题。近年来,细胞生物学、组织工程学和材料学的发展为替代人角膜材料开辟了更广阔的前景;而且以深板层移植和内皮移植为代表的成分板层移植的推陈出新从临床技术上有力地推动了组织工程角膜的研发。现就脱细胞角膜基质板层材料、上皮细胞和内皮细胞组织工程的基础研究和临床应用进展进行述评。     

组织工程角膜内皮移植研究进展

由于角膜供体材料严重短缺, 穿透角膜移植术及角膜内皮移植术的临床广泛开展受到严重制约, 其根本原因在于健康角膜内皮的增生能力有限。随着组织工程技术和细胞工程技术不断发展, 组织工程角膜研究已取得一定进展, 应用组织工程技术体外培养高密度、具备健康内皮功能的角膜内皮细胞进行移植是当前研究的热点。组织工程角膜内皮技术研发的关键在于种子细胞、载体材料和移植方式的选择。目前, 国内外大量研究的种子细胞来源包括人角膜内皮细胞、干细胞、血管内皮细胞及人羊膜上皮细胞等。常见的载体材料包括羊膜、脱细胞角膜基质、后弹力层、晶状体前囊膜等。体外培养的细胞采用穿透角膜移植术、角膜内皮移植术或前房注射细胞的方式进行移植。本文从角膜内皮种子细胞来源、移植载体选择以及角膜内皮移植方法等方面就组织工程角膜内皮移植研究进展进行综述, 总结目前研究面临的问题并展望其前景。     

体外培养角膜内皮细胞移植的实验研究

目的　探讨体外培养角膜内皮细胞移植的手术方法及移植后在活体的生理功能。方法　植片 :以直径 7 5mm、厚 10 0 μm、冷冻脱水保存的猪角膜后弹力膜 (Descemet′smembrane ,DM ) /基质为载体 ,原代接种兔角膜内皮细胞 ,体外培养 7～ 10d ,用于移植。受眼 :新西兰兔 3 0只 ( 3 0眼 ) ,实验组 2 0眼 ,对照组 10眼 ,全角膜范围去除术眼内皮细胞 ,5周后施行手术 ;做直径 9mm、3 / 4角膜厚的带蒂前层角膜瓣并掀置一侧 ,再用直径 7 2 5mm的环钻钻去中央后层角膜 ,形成植床 ;将植片置于植床 ,8-0可吸收线间断缝合 ,10 -0尼龙线间断缝合前层角膜瓣 ,术后观察 1～ 12个月。结果　术后角膜持续透明 6个月 14眼 ( 14 / 18、 77% ) ,12个月 8眼 ( 8/ 14、 5 7% ) ;术后 6个月内皮细胞密度 ( 193 4± 3 0 7)个 /mm2 ,角膜厚度平均为 ( 3 92± 3 9) μm。 结论　以异种DM /基质为载体培养的兔角膜内皮细胞 ,行同种异体移植后 ,能够在活体上成活 ,并具有正常内皮细胞的生物学功能 ,维持角膜透明 ,深板层角膜内皮移植术是体外培养内皮细胞移植的一种有效术式。     

角膜内皮细胞移植

角膜内皮细胞在体外培养的条件下可以在同种异体或异种角膜后弹力层上成功生长,培养的上皮细胞的生长情况及特性与供体年龄、内皮细胞来源部位、载体材料、培养条件、以及是否应用生长因子有密切关系。人角膜内皮细胞培养的成功,以及在非人类的灵长目动物眼上的成功移植,为内皮移植技术的治疗作用提供了实验基础。培养传代的角膜内皮细胞移植到活体上后具有正常内皮细胞的功能,可以作为穿透性角膜移植的替代方法之一加以选择。     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

异种角膜脱细胞基质为供体进行角膜前板层移植的初步研究

目的探讨以异种猪角膜脱细胞基质为供体植片,分析兔角膜进行前板层移植后的生物相容性：设计实验研究。研究对象新西兰白兔。方法应用1％TritonX-100及冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,切取1／3厚度前板层作为供体角膜植片,对兔眼角膜前板层切除后进行移植,同时以新鲜猪角膜板层为供体对兔进行前板层移植作对照。通过术后角膜透明度、组织结构观察,评价猪角膜脱细胞基质的生物相容性及植片转归的情况。主要指标角膜透明度和组织学HE染色。结果制备的猪角膜脱细胞基质植片作前板层移植到兔眼后,未见明显的新生血管、炎症反应、角膜坏死等排斥现象,观察期内植片较透明;脱细胞基质表面上皮化良好,植片基质板层与植床逐渐融合,植片内有宿主细胞迁入生长,板层结构与正常角膜相似。结论猪角膜脱细胞基质具有良好的生物相容性、安全性和低抗原性,有望成为角膜板层移植的供体材料。     

以羊膜为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞并形成单层组织，为以后内皮细胞层移植提供方法和材料来源。方法 胰酶消化去除羊膜上皮细胞，保留其底膜作为载体，种植兔角膜内皮细胞，体外培养形成单层内皮层，并进行形态，组织学，超微结构观察。结果 角膜内皮细胞在羊膜上黏附生长并增殖，体外培养6-7d即融合成单层，其形态及生长密度优于单纯培养皿上培养的内皮细胞。复合角膜内皮组织由羊膜基底膜和单层扁平内皮细胞组成，与生理状态下的角膜内皮组织相近。结论 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞可形成单层细胞层，有望成为角膜内皮移植良好的材料来源。     

角膜内皮细胞移植术的新进展

随着组织工程和细胞工程技术的发展 ,体外培养角膜内皮细胞取得成功 ,由此而探索出一种新手术———角膜内皮细胞移植术。这种手术是将体外培养的角膜内皮细胞或直接获取供眼健康的角膜内皮细胞 ,移植到受体眼已去除自身内皮细胞的角膜上 ,保证了受体角膜有足够健康的内皮细胞并减少了排斥反应。最新研究结果为通过一 5mm宽的巩膜隧道切口 ,以后弹力膜作载体 ,把健康活性角膜内皮细胞移植到受体眼。该方法手术切口小 ,无缝线 ,移植后的内皮细胞完整无损 ,贴附良好 ,术后并发症少 ,已有临床成功病例的报道。角膜内皮细胞移植术将为角膜病患者带来新的治疗方法。     

角膜内皮细胞移植术的新进展

随着组织工程和细胞工程技术的发展，体外培养角膜内皮细胞取得成功，由此而探索出一种新手术——角膜内皮细胞移植术。这种手术是将体外培养的角膜内皮细胞或直接获取供眼健康的角膜内皮细胞，移植到受体眼已去除自身内皮细胞的角膜上，保证了受体角膜有足够健康的内皮细胞并减少了排斥反应。最新研究结果为通过-5mm宽的巩膜隧道切口，以后弹力膜作载体，把健康活性角膜内皮细胞移植到受体眼。该方法手术切口小，无缝线，移植后的内皮细胞完整无损，贴附良好，术后并发症少，已有临床成功病例的报道。角膜内皮细胞移植术将为角膜病患带来新的治疗方法。     

以异种后弹力膜基质为载体培养角膜内皮细胞的研究

目的　探讨以异种后弹力膜 (DM) /基质为载体培养角膜内皮细胞的可行性 ,为培养内皮细胞的临床移植提供新的方法和供体材料。方法　取厚 10 0 μm的猪角膜后层 ,冻存解冻后置中性蛋白酶 3 7℃孵育 5min ,去除内皮细胞 ,保留DM及薄层基质 ,置纯甘油中脱水保存 6个月 ;使用前复水 ,紫外线二面灭菌 ,制备成载体 ;接种兔角膜内皮细胞于载体的DM面并体外培养 ,行细胞形态、密度、组织学、超微结构的观察。结果　兔内皮细胞在猪DM/基质载体上贴附生长 ,形成紧密连接的单层 ,形态近似六角形分布 ;细胞密度达 ( 3 62 0± 110 2 3 )个 /mm2 ,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论　角膜内皮细胞能够在异种DM/基质载体上良好生长 ,该载体有可能成为培养内皮细胞应用于临床移植的供体材料     

角膜内皮细胞移植的研究

穿通性角膜移植术是目前临床上治疗各种角膜疾病所致的角膜混浊恢复视力的主要治疗方法，但角膜材料的来源非常有限，另外随着人沟寿命的延长，许多高龄供体的角膜不适宜作为移植材料等诸多因素均限制了该手术的广泛开展。近年来不断兴起的角膜内皮细胞移植的研究，可望为角膜病患者提供一种新的治疗方法。它是将取自胎儿或其它动物的角膜内皮细胞进行组织细胞培养，再将其接种在除去了自身的内皮细胞层的异体或受试动物自体的角膜基质上，培养后再进行穿通性角膜移植术，以保证移植材料上有足够的内皮细胞数，当利用受者自身的角膜作为内皮细胞移植的载体时，免疫排斥反应亦会大大地降低。     

人角膜内皮细胞的原代培养及形态学观察

人角膜内皮细胞体外培养的成功,为现代研究角膜内皮细胞的生物学、病理学以及内皮细胞移植等方面开拓了广阔的前景.近年来,我国在角膜内皮细胞培养方面已获得成功,并且在细胞培养技术方面有所改进,这些无疑将促进我国角膜病基础学研究的进展.我们在国内对人角膜内皮细胞体外原代培养成功的基础上,对其某些生物学特点进行观察研究,现将结果报告如下:     

无缝线深板层角膜内皮移植术的研究进展

角膜内皮失代偿可严重影响视力,以往多采用的穿透性角膜移植手术(PKP)具有术后高度散光、移植片排斥等并发症,严重限制了术后视力的提高.如果能够单纯地进行后弹力层和内皮细胞层的移植,将减少手术操作所带来的受体角膜损伤并能更好地恢复术后视力.近年来,无缝线深板层角膜内皮移植手术的优点已逐渐获得公认;其中深板层角膜内皮细胞移植手术(DLEK)手术难度较大,限制了其在临床的广泛开展.而通过剥除受体角膜的后弹力层和内皮层来制作植床的角膜内皮移植手术即角膜后弹力层剥除内皮细胞移植手术(DSEK)已经取得了较好的手术效果.本文归纳、分析了DSEK的手术方法、效果及并发症等.     

对角膜板层移植治疗碱性烧伤的评价：附46例远期随访观察

本文评价了46眼碱性烧伤后行角膜板层移植平均随访11.2年的结果,对轻、中度碱性灼伤行角膜板层移植可以获得较高的植片透明率,而重度碱烧伤因为角膜内皮细胞的严重损害,而不宜采用单纯的角膜板层移植手术,同时作者阐述了对该类病人在手术学上的观点。     

组织工程角膜内皮细胞移植的研究与进展

由于角膜供体材料严重短缺以及供体年龄限制,穿透性角膜移植术的临床广泛开展受到严重制约,应用组织工程体外培养高密度、具备常规六角形态和健康内皮功能的角膜内皮细胞是当前研究的热点。本文就角膜内皮种子细胞的来源、载体的选择及角膜内皮细胞移植方法、免疫机制等方面研究的最新进展进行综述,总结目前研究面临的问题并展望其前景。     

自动角膜板层刀切割一个供体角膜用于两位患者

目的评估应用自动角膜板层刀切割一个供体角膜用于深板层角膜移植和角膜内皮移植的临床疗效及安全性。方法回顾性系列病例研究。应用自动角膜板层刀预先将新鲜供体角膜进行切割,将带部分基质的角膜内皮植片用于角膜内皮移植术,剩余前板层用于深板层角膜移植术。回顾性分析2010年3—8月期间在温州医学院附属眼视光医院行角膜内皮移植术的17例患者及分别来自同一供体角膜的行深板层角膜移植的17例患者。术后随访19～24个月,分别观察角膜内皮贴附情况及前板层角膜植片愈合情况。随访资料包括医学验光、前节光学相干断层扫描及角膜内皮细胞计数。手术前后视力比较采用配对t检验。结果17例角膜内皮移植患者术后角膜内皮植片均贴附良好,术后视力较术前均有提高。除1例碱烧伤患者因晶状体混浊,无法验光外,其余术后平均散光为（1．69±0．60）D。17例角膜内皮移植患者平均角膜内皮细胞计数为（2128±244）个／mm^2,平均角膜内皮植片厚度为（152±46）μm。17例前板层角膜移植患者角膜植片均透明,术后最佳矫正视力较术前提高,平均散光为（2．50±0．90）D;平均前板层角膜植片厚度为（343±39）μm。结论利用角膜板层刀将一个供体角膜用于两位患者的方法在临床实际应用中切实可行。经长期随访,角膜植片未出现明显并发症。该方法可以更充分地利用供体角膜,缓解中国供体角膜匮乏现状,意义重大。