骨髓间充质干细胞诱导分化成骨方法的研究与进展

背景：骨髓间充质干细胞具有良好的成骨分化潜能,移植入体内后可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、肝脏和神经等多种细胞。目的：综述大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成骨最新方法进展。方法：分别以“骨髓间充质干细胞,成骨细胞,诱导分化”、“bone mesenchymal stem cells,osteoblast cells,osteogenic differentiation”为检索词,应用计算机检索CHKD期刊全文数据库,PubMed数据库和万方数据库1995至2011年有关文章。纳入有关骨髓间充质干细胞的文献。排除内容重复和缺乏原创性文献。保留34篇文献做进一步分析。结果与结论：骨髓间充质干细胞在适当的生长因子诱导下可以快速地向成骨细胞分化和增殖。在体外诱导骨髓问充质干细胞向成骨细胞分化需要特定的诱导条件、优良的诱导剂以及合适的剂量。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化受许多自身调控因素（控制基因表达的转录因子）和环境调控因素（分泌因素、细胞外基质,化学因素、细胞与细胞间的相互作用）的影响,这些调控因素并不是孤立存在的,而是相互联系、相互作用,共同调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。,     

肝干细胞的分离培养和诱导分化及应用

近年来,肝干细胞的基础研究已取得重大进展,肝干细胞可分化为肝细胞和胆管细胞已经得到了共识.目前多用两步胶原酶灌流消化法、密度梯度离心法、离心淘洗技术、荧光激活细胞筛选法及免疫磁珠细胞筛选法进行肝干细胞的分离纯化.然而肝干细胞的定向分化是一个复杂的过程,是在一些细胞内外因素及肝脏微环境的作用下完成的.肝脏微环境有利于干细胞的生长、分化与功能发挥.肝细胞牛长因子能够促进肝干细胞生长增殖,并且促进其向成熟肝细胞分化,肝细胞转录因子在肝干细胞的分化调控中也起重要作用.肝癌可能是肝干细胞分化不全或分化异常所致,肝干细胞可望作为靶向基因治疗肝癌极具潜力的载体细胞.     

胰腺β细胞分化的信号通路调控

细胞替代治疗给糖尿病的根治带来了新希望.文章综述了近年来干细胞向胰岛细胞定向分化的分子研究进展,综合分析细胞信号通路在β细胞分化发育过程中所发挥的作用.其中Wnts信号是通过阻止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录,促进干细胞向内胚层分化;Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响,当Notch活性被抑制时,干细胞进入分化程序,发育为功能细胞;Hedgehog信号转导对许多发育过程是必须的,其主要以浓度依赖方式控制细胞的增殖、分化和组织的形成,这些信号通路按一定的顺序上调或下调,以启动PDX1等β细胞分化相关的转录因子的表达,从而调控着β细胞的分化发育.因此深入分析并通过调控这些信号通路为以后进行相关细胞定向分化,获取发育成熟、功能完整的β细胞,进行细胞治疗糖尿病奠定基础.     

人骨髓基质细胞参与造血调控的研究进展

人骨髓基质细胞（hBMSs）对造血细胞的增殖及分化有支持、诱导和调控作用。上述作用的分子基础主要涉及特异性细胞表面受体、生长因子、细胞粘附分子（CAMs）及细胞外基质（ECM）分子等,这些分子的相互作用介导了细胞间的粘附和造血干细胞的归巢。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响

背景:缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的.目的:观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响.方法:贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3～5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达.将骨髓间充质干细胞分四组:常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h).RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子mRNA表达水平,ELISA检测骨髓间允质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平.结果与结论:同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P<0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P<0.05).证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素.     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

不同因子影响骨髓间充质干细胞的多向分化

背景：在组织工程领域,关于骨髓间充质干细胞定向诱导分化的研究越来越多,但是细胞培养基中不同成分会对骨髓间充质干细胞的体外增殖分化产生影响。目的：针对培养基中不同因子对骨髓间充质干细胞定向诱导分化的作用加以综述。方法：第一作者应用计算机检索1998年1月至2012年4月Pubmed数据库及万方数据库。检索英文关键词为“bone marrow mesenchymal stromal cells, cell culture medium, differentiation”,中文关键词为“骨髓间充质干细胞,细胞培养,定向诱导分化”,纳入有关不同因子对骨髓间充质干细胞向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞定向诱导分化作用的文献,排除重复研究。结果与结论：计算机初检共得到184篇文献,根据纳入排除标准,对其中30篇文献进行综述。大体说来,骨髓间充质干细胞向成骨分化的主要因子有地塞米松、转化生长因子、维生素C、维生素D3、β-甘油磷酸钠及乙烯雌酚等;向软骨分化的主要因子有地塞米松、转化生长因子、维生素C、胰岛素样生长因子及成纤维细胞生长因子等;向脂肪细胞转化的主要因子有地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和消炎痛等,但是其中一些因子的作用机制及不良反应还不明确,需要进一步的研究与验证。同时,骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量较低,不同的分离方法会导致不同的分离率,因此如何选取一种分离率高的分离方法仍有待研究。     

多种神经营养因子联合诱导培养骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞的定向分化

背景:轴突再牛后髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化.目的:探讨骨髓间充质干细胞经神经营养因子诱导培养后,向少突胶质样细胞定向分化的可行性.设计、时间及地点:细胞分子生物学的体外实验,于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成.材料:选用2～4周龄SD大鼠5只,雌雄不拘,取其舣侧股骨、胫骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞.培养用诱导因子表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子为美国Invitrogen公司产品.方法:取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL表皮生长因子、N2添加剂的无血清培养基的诱导液诱导48 h后,加含500 ng/mL胰岛素样生长因子1、N2添加剂的分化培养液培养3 d.主要观察指标:相差显微镜观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化.半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达.应用神经元细胞标志物抗微管相关蛋白,星形胶质细胞标志物抗神经纤维酸性蛋白,少突胶质细胞标志物抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质样细胞的阳性率.结果:①骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞诱导分化过稃中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典犁的网状结构.②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带.③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%.磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%.结论:碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞定向分化.     

基质蛋白与整合素参与人骨髓间充质干细胞体外内皮的分化

目的:探讨基质蛋白与整合素在人骨髓间充质干细胞体外内皮分化过程中的作用,进一步明确其分化机制.方法:实验于2001-10/2003-03在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成.采用不同基质蛋白纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原,在诱导因子血管内皮细胞生长因子作用下对人骨髓间充质干细胞进行内皮诱导分化.通过免疫细胞化学和流式细胞分析检测分化标志和β1整合素.结果:纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原组细胞诱导后可引起内皮分化早期标志KDR和CD34增强,纤维连接蛋白效应较为明显;两种基质蛋白也引起分化细胞β1整合素表达增强.结论:细胞外基质-整合素受体和血管内皮生长因子相互作用调控人骨髓间充质干细胞分化;人骨髓间充质干细胞诱导后具备内皮分化趋势;β1整合素的改变参与人骨髓间充质干细胞的内皮分化.该研究为寻找组织修复再生、心肌梗死和缺血性疾病治疗,以及血管组织工程的新型种子细胞提供了新的思路和方法.     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.