RNA干扰骨髓基质细胞衍生因子表达对共培养Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨阻抑骨髓基质细胞衍生因子(SDF1)表达对与其共培养的Jurkat细胞增殖、凋亡的影响。方法脂质体介导SDF1特异性RNA干扰质粒转染培养的急性白血病骨髓基质细胞,G418筛选阳性克隆(A组),采用ELISA法检测SDF1表达变化;与Jurkat细胞共培养,绘制生长曲线并计算倍增时间,用流式细胞术检测细胞周期,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl2、Bax、Fas、FasL表达。以未转染急性白血病骨髓基质细胞(B组)及正常骨髓基质细胞(C组)作为对照。结果A组骨髓基质细胞培养上清SDF1含量为(384±41)pg/ml,较B组[(2474±271)pg/ml]、C组[(1324±154)pg/ml]明显降低。与之共培养的Jurkat细胞,A组与B组、C组比较,细胞增殖速度减缓,倍增时间延长(A组42h,B组29h,C组33h);细胞周期分析G0/G1期细胞比例增多[A组(28.47±2.39)%,B组(19.43±2.80)%,C组(27.15±2.07)%],S期细胞减少[A组(25.57±1.90)%,B组(74.48±3.23)%,C组(60.99±2.33)%],G2/M期细胞增多[A组(45.96±3.24)%,B组(6.09±1.96)%,C组(11.86±1.98)%];细胞凋亡率增加[A组(15.2±0.8)%,B组(5.4±0.7)%,C组(9.5±0.4)%];PCNA、Bcl2、Fas表达减少,Bax、FasL表达增多。结论阻抑SDF1表达在一定程度上抑制与骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞的增殖活性,并促进其凋亡。     

白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞IAP家族主要成员表达的影响

目的:观察白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞化疗敏感性及IAP家族主要成员表达的影响。方法:Jurkat细胞与60Co照射的基质细胞层黏附培养构建共培养模型,扫描电镜观察,0.5μmol/L DNR作用24h后FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪定量Jurkat细胞的凋亡率。Western blot检测黏附培养4、24及48h时Jurkat细胞总蛋白中XIAP和survivin的表达变化,流式细胞仪检测Jurkat细胞周期分布。结果:白血病基质细胞黏附培养组、正常基质细胞黏附培养组Jurkat细胞凋亡率分别为(6.05±0.54)%、(8.48±0.86)%,与悬浮对照组(25.74±6.15)%比较差异均有显著性(P<0.01),且白血病基质细胞黏附培养组与正常基质细胞黏附培养组间差异也有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果示,与白血病基质细胞黏附培养4h即观察到XIAP表达的上调,24h和48h尤为明显,但survivin表达的变化呈现相反趋势。与Western blot结果相一致,Jurkat细胞周期阻滞于G0-G1期。结论:白血病骨髓基质细胞黏附培养能介导Jurkat细胞耐药,其机制可能与Jurkat细胞XIAP表达上调和survivin表达下调有关。     

直接接触骨髓基质HS-5细胞可降低HEL细胞对药物的敏感性

本研究探讨与骨髓基质HS-5细胞直接接触对HEL白血病细胞耐药性的诱发作用及其机制。采用人急性红白血病HEL细胞株与HS-5细胞共培养模式模拟体内白血病细胞及其周围的造血微环境,应用CCK-8法检测HEL细胞对Ara-C,DNR,VP16,MTX等化疗药物的敏感性,流式细胞术检测HEL细胞周期时相分布,实时RT-PCR方法检测p19、p21、p27、MDR1、ABCG2、Bcl-2等基因的mRNA表达,Western blot方法检测p-AktSer473、p-GSK3βSer9、p-STAT3Tyr705、Bcl-2、cleaved-Notch1V1754及Hes1等蛋白表达。结果表明,与HS-5细胞共培养后的HEL细胞对4种化疗药物的敏感性均显著降低。在共培养24 h时,HEL细胞阻滞于G0/G1期,G0/G1期的细胞比例明显增多。PCR结果显示,p21基因的转录水平随着共培养时间的延长逐渐上调;p19基因的mRNA水平在12 h时明显下调,随后又恢复;其它基因的改变均无统计学意义。Western blot结果表明,共培养后HEL细胞的p-AktSer473、p-GSK3βSer9、cleaved-Notch1V1754蛋白及Bcl-2蛋白表达上调,Hes1蛋白表达下调,p-STAT3Tyr705表达无明显变化。结论:直接接触骨髓基质HS-5细胞可增强HEL细胞对化疗药物的抵抗作用。     

血管细胞粘附分子-1与骨髓基质细胞

血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)是一种重要的细胞粘附分子,VCAM-1与VLA-4结合后导致构型改变,都成为高亲和力的粘附分子,处于活化状态,能使造血干细胞在骨髓基质细胞上形成聚集体,并参与造血干细胞的迁移、归巢、定居和分化等功能。在病理条件或受辐射时的VCAM-1无论是表达还是功能都有很大的变化。     

基质衍生因子-1与急性白血病细胞的相互作用

基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是一种由骨髓基质细胞释放的趋化因子,是趋化因子CXC亚家族的成员之一。近年的研究表明,SDF-1不仅与正常机体造血功能的维持及造血干/祖细胞的回髓定位和植入有密切的关系,同时与各种白血病细胞的移动和功能之间也存在着复杂的相互作用。本文重点就SDF-1与急性白血病细胞之间的相互作用的研究现状作一综述。     

原代白血病骨髓基质细胞对Jurkat细胞CRIF1基因表达的影响

目的研究与原代白血病骨髓基质细胞共培养后。白血病细胞的CRIF1基因表达情况。方法:1)采用Percoll体外分离正常、初治白血病患者骨髓单个核细胞,贴壁培养骨髓基质细胞;2)应用RT-PCR技术检测白血病骨髓基质细胞屏蔽的Jurkat细胞CRIF1 mRNA表达的改变。结果发现Jurkat细胞CRIF1 mRNA有一定量的基础表达,白血病骨髓基质细胞屏蔽的Jurkat细胞CRIF1 mRNA的表达与对照组相比明显上调。结论CRIF1高表达可能与白血病骨髓基质细胞抑制白血病细胞增殖有关。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响

背景:缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的.目的:观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响.方法:贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3～5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达.将骨髓间充质干细胞分四组:常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h).RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子mRNA表达水平,ELISA检测骨髓间允质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平.结果与结论:同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P<0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P<0.05).证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素.     

基质衍生因子—1与急性白血病细胞的相互作用

基质细胞衍生因子－1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）是一种由骨髓基质细胞释放的趋化因子,是趋化因子CXC亚家族的成员之一。近年的研究表明,SDF－1不仅与正常机体造血功能的维持及造血干／祖细胞的回髓定位和植入有密切的关系,同时与各种白血病细胞的移动和功能之间也存在着复杂的相互作用。本文重点就SDF－1与急性白血病细胞之间的相互作用的研究现状作一综述。     

急性白血病骨髓基质细胞Connexin 43的表达及细胞间通讯功能研究

本研究探讨急性白血病和正常骨髓基质细胞中连接蛋白43（connexin 43, Cx43）的表达及细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication, GJIC）功能的变化及二者细胞通讯功能之间的差异。体外培养正常及急性白血病骨髓基质细胞,采用细胞免疫组织化学方法及计算机灰度检测观察二者之间Cx43表达的变化,采用细胞划痕染料传输技术比较两者之间GJIC功能的差异。结果显示,体外培养的急性白血病骨髓基质细胞Cx43的表达较正常骨髓基质细胞Cx43的表达明显减低,GJIC功能减弱。结论：急性白血病骨髓基质细胞间通讯功能较正常骨髓基质细胞明显减低。     

白血病骨髓基质细胞中GATA-1和GATA-2基因的表达特点

为了解转录因子GATA-1和GATA-2基因在白血病和正常骨髓基质细胞(BMSC)中表达的情况,采集了42例白血病患者的骨髓标本及34例正常骨髓标本并分离骨髓单个核细胞,在体外扩增培养后收集悬浮细胞(骨髓细胞)和扩增后的贴壁细胞(BMSC),应用RT-PCR-ELISA方法分别检测GATA-1和GATA-2基因的表达情况,并对其相对表达水平进行半定量分析.结果发现,GATA-1和GATA-2基因在正常和白血病的BMSC和骨髓细胞中均有一定的表达.在BMSC中急性淋巴细胞白血病(ALL)组的GATA-1基因表达率(857%)与正常组(882%)相近,而急性髓性白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)组的GATA-1表达率(55.6%和41.2%)均比正常组低(P=0.008,0.000),且ALL的BMSC中GATA-1基因表达水平＞AML＞正常＞CML(P均＜0.05);而各白血病组BMSC中GATA-2的表达率和表达水平与正常组相比均无显著性差异(P均＞0.05).骨髓细胞中AML组的GATA-1基因表达水平＞正常＞ALL＞CML,AML组的GATA-2基因表达水平＞CML＞ALL＞正常(P均＜0.05).AML、CML和正常组的BMSC和骨髓细胞中均以GATA-2的表达占优势.可以推论,转录因子GATA-1和GATA-2基因在正常和白血病BMSC的表达可能影响骨髓微环境的造血调控作用.是否对白血病的发生发展有一定的影响也值得进一步探索.     

RNA干扰ERCC1基因对肺癌细胞药物敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰切除修复交叉互补基因1(ERCC1)对肺癌细胞药物敏感性的影响.方法 将肺癌A549/DDP细胞分为阴性组、空白组、ERCC1-shRNA1组及ERCC1-shRNA2组,通过不同方法检测分析ERCC1的mRNA和蛋白表达水平,及不同顺铂(DDP)浓度下肺癌细胞的凋亡程度.结果 阴性组、空白组的ER...     

RNA干扰技术抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达的研究

目的 抑制SALL4基因在急性白血病细胞THP-1中的表达,探讨其在白血病发病机制中的作用.方法 将表达SALL4干扰序列的质粒载体转染至急性白血病细胞THP-1中,分为4组:(1)空白对照组:不加处理;(2)转染对照组:加入空pRS质粒载体;(3)转染一组:加入SALL4-shRNA-pRS-1干扰质粒的转染复合体;(4)转染二组:加入SALL4-shRNA-pRS-2干扰质粒的转染复合体.采用实时荧光定量PCR和WB技术观察THP-1细胞中SALL4基因mRNA及蛋白表达的变化,建立抑制SALL4表达的体系.实时荧光定量PCR检测SALL4受抑后Wnt/β-catenin信号通路中C-myc、Cyclin D1、β-catenin基因的表达改变,采用流式细胞术分析THP-1细胞凋亡情况.结果 实时荧光定量PCR结果 显示,转染一组、转染二组、转染对照组、空白对照组SALL4基因的表达水平分别为(36.0±4.3)%、(32.0±2.4)%、(102.0±6.5)%、(100.0±2.6)%,差异有统计学意义(F=226.3,P<0.05);转染一组、转染二组的SALL4基因表达水平显著低于空白对照组,差异有统计学意义(t值分别为19.7、19.1,P<0.05);转染对照组SALL4基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(t=1.1,P＞0.05).WB检测结果 显示,转染一组、转染二组SALL4蛋白表达与空白对照组和转染对照组相比明显下降.以上基因和蛋白表达水平均提示SALL4干扰效率良好.SALL4基因抑制表达后,转染一组C-myc基因、β-catenin基因、Cyclin D1基因的表达分别为(44.0±6.2)%、(44.0±5.1)%和(107.0±13.6)%,转染二组为(22.0±4.5)%、(25.0±3.5)%和(48.0±7.6)%,转染对照组为(42.0±3.5)%、(59.0±3.7)%及(79.0±5.6)%.转染一组、转染二组C-myc基因表达水平显著低于空白对照组的(103.0±7.5)%,差异有统计学意义(t值分别为10.1、9.5,P均<0.05);转染一组、转染二组β-catenin基因的表达显著低于空白对照组的(100.0±4.1)%,差异有统计学意义(t值分别为23.3、22.9,P均<0.05);转染一组、转染二组Cyclin D1基因的表达显著低于空白对照组的(102.0±6.0)%,差异有统计学意义(t值分别为17.4、12.4,P均<0.05).SALL4基因被抑制后,转染一组、转染二组、转染对照组及空白对照组的细胞凋亡率分别为(57.2±9.1)%、(34.4±8.6)%、(14.4±3.6)%及(14.8±4.8)%,差异有统计学意义(F=42.5,P<0.05).转染一组、转染二组细胞凋亡率显著高于空白对照组(t值分别为9.7、4.5,P均<0.05).结论 抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达后,Wnt/β-catenin信号通路的C-myc、Cyclin D1及β-catenin基因的表达随之下调,并促进了细胞凋亡.     

IGF-1通过ERK-MNK信号通路诱导骨髓间充质干细胞VEGF表达的实验研究

目的 探讨ERK-MNK信号通路是否参与IGF-1对骨髓间充质干细胞VEGF表达的诱导.方法 免疫印迹方法检测IGF诱导的骨髓间充质干细胞内HIF-1α、p-MNK等信号蛋白的表达变化和VEGF表达的变化,给予MNK抑制剂CGP 57380和HIF-1α抑制剂YC-1后再检测含外源性IGF-1的骨髓质间充质细胞中VEGF的表达水平.结果 外源性IGF诱导后,HIF-1α、p-MNK等相关信号蛋白表达上调,分别阻断MNK和HIF后,VEGF的表达趋于正常.结论 IGF-1通过调节ERK-MNK信号通路诱导骨髓间充质干细胞BMSCS表达VEGF.     

应用RNA干扰技术抑制白血病细胞血管内皮生长因子基因表达及功能的研究

目的探讨用RNA干扰技术下调血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞生长的影响。方法设计3段分别针对VEGF第3~5外显子的短发夹状RNA(shRNA)并构建其表达载体,分别转染人白血病细胞株NB4,用实时定量PCR及Western blot方法观察3段shRNA对细胞内VEGF基因表达的影响。抗性筛选稳定抑制VEGF表达的永久细胞克隆,应用MTT法、甲基纤维素半固体培养法及细胞周期动力学检测了解VEGF基因缄默对白血病细胞生长的影响。结果成功构建分别携带3段shRNA及对照随机片段的重组质粒pGenesil-VR1,2,3和pGenesil-con,3种shRNA重组质粒中pGenesil-VR3可明显降低细胞内VEGF mRNA的丰度及VEGF蛋白表达,筛选出的NB4-VR3细胞株增殖能力明显下降,细胞集落形成率为(13.3±3.8)%,与NB4-con的(21.3±6.4)%和NB4组的(24.5±5.2)%相比,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期阻滞于G1期,3组细胞G1期比例分别为(53.2±4.6)%、(42.7±5.9)%和(40.5±5.3)%。结论应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断VEGF基因表达及功能的shRNA,VEGF基因表达下调能明显抑制白血病细胞生长。     

TGF-β1和IGF-1对人骨髓基质干细胞体外增殖和分化的影响

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）和胰岛样细胞生长因子-1（IGF-1）对人骨髓基质干细胞（BMSC）体外增殖、分化的影响。方法8份标本分两组,每组4份,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B组加入TGF-β1和IGF-1,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色：原代细胞阴性;传代细胞,A组淡染或阴性,B组呈蓝色;Ⅱ型胶原mRNA表达：A组未检出,B组阳性。结论TGF-β1和IGF-1在体外可诱导人BMSC分化为软骨样细胞,但同时其增殖能力减弱。     

Berberine inhibits SDF-1-induced AML cells and leukemic stem cells migration via regulation of SDF-1 level in bone marrow stromal cells

Berberine plays a prominent role on the control of tumor cell invasion and migration. SDF-1 is a homeostatic chemokine that signals through CXCR4 which is expressed by hematopoietic tumor cells. The SDF-1/CXCR4 axis is involved in the migration process of leukemic cells. In this study, we investigated the effects of berberine on the SDF-1-induced HL-60 cells, primary acute myeloid leukemia (AML) cells and leukemic stem cells (LSCs) migration. Transwell migration chambers (8 μm) were used to assess the role of berberine on leukemic cell migration; Flow cytometry was used to analyze the role of berberine on the CXCR4 expression; SDF-1 protein level secreted by bone marrow stromal cells (BMSCs) was evaluated by ELISA. Results demonstrated that berberine could partly inhibit SDF-1-induced AML cells as well as LSCs migration. Berberine could reduce SDF-1 protein level secreted by BMSCs in the microenvironment but not affect CXCR4 expression on HL-60 cell membrane, and we hypothesized that berberine could inhibit AML cells migration partly by reducing the secreting of SDF-1 by BMSCs and inhibiting HERG1 K⁺ channels of leukemic cells. Therefore, it is speculated that berberine might be a potentially effective agent for prevention of leukemia.     

抑制核小体结合蛋白对人膀胱癌细胞增殖的影响

目的探讨核小体结合蛋白（NSBPI）对人膀胱癌细胞增殖的影响。方法采用脂质体转染法将NSBP1基因转入膀胱癌EJ细胞系,分别通过CCK8、流式细胞仪、Real—TimePCR及Westernblot法观察EJ细胞的增殖,细胞周期时相的分布、凋亡以及CyclinDl、CyclinBl、Bcl-2蛋白的表达。结果Real．TimePCR及Western blot结果显示经转染后EJ细胞的NSBPl显著地受到抑制（P〈0．01）。CCK8结果提示EJ细胞转染后随着时间的延长,抑制率越大（P〈0．01）。流式细胞仪检测发现,经转染干预后EJ细胞G2期比例增加（P〈0．01）,而凋亡细胞并没有显著变化（P〉0．05）。Western blot结果再次验证周期蛋白CyclinBl显著下调（P〈0．05）,而CyclinD1没有统计学意义（P〉0．05）,凋亡蛋白Bcl-2也没有统计学意义（P〉0．05）。结论NSBPl是通过调控周期蛋白CyclinB1进而阻断或延缓细胞周期,而非通过细胞凋亡抑制膀胱癌细胞增殖。NSBPl在膀胱癌细胞增殖中起着重要作用。     

RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究

目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT)，转导入肝癌细胞7721，在瘤细胞内诱导RNAi，采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37．5％；细胞周期中S期细胞明显减少，G1／G0期细胞显著增加；hTERT基因的mRNA表达由99．4％下调到53．1％，其蛋白表达由86．3％下调到46．6％。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

术前静脉注射氯诺昔康对子宫切除术患者围术期血浆基质细胞源性因子-1表达的影响

目的 研究术前静脉注射氟诺昔康对子宫切除术患者围术期基质细胞源性因子-1（SDF-1α）表达的影响。方法择期行子宫切除术的患者30例，随机分为对照组、氟诺昔康8mg组、氟诺昔康16mg组10例。氟诺昔康8mg组在开放静脉后静脉注射氟诺昔康8mg，氟诺昔康16mg组在开放静脉后静脉注射氟诺昔康16mg。分别在开放静脉前、手术开始后30min、手术结束、术后24h和术后48h采集静脉血，测定血浆SDF．1et浓度。结果 ①3组患者血浆SDF-1α浓度在手术开始后30min升高并迅速达到峰值，分别为（2062±298）、（1472±313）和（1103±211）ng／L，与术前比较差异有统计学意义（P〈0．05）；②氟诺昔康8mg组和16mg组在手术开始后30min和术毕时血浆SDF．1et浓度分别为（1472±313）、（1012±207）ng／L和（1103±211）、（911±102）ng／L，均较对照组低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。③氟诺昔康16mg组在手术开始后30min和术毕时血浆SDF-1α浓度低于8mg组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论手术和麻醉可以造成SDF-1α表达增加，术前静脉注射氟诺昔康8mg或16mg可以有效地抑制SDF-1α的表达，16mg可能优于8mg，氟诺昔康预处理有助于维持子宫切除患者围术期的免疫功能稳定。