小鼠OC-STAMP蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 OC-STAMP蛋白是一种功能尚不明确的六次跨膜蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pGEX-4T-1/OC-STAMP表达含重组谷胱甘肽转移酶（GST）的融合蛋白GST-OC-STAMP.GST-OC-STAMP融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pGEX-4T-1/OC-STAMP重组质粒构建成功,并通过原核表达获得达到免疫要求的融合蛋白.免疫所得抗体血清经间接ELISA法、Western blot检测,确定获得了高效价的小鼠OC-STAMP多克隆抗体.结论 成功制备了小鼠OC-STAMP抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.     

改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备其多克隆抗体。方法利用原核表达载体PGEX-6P-1/改良型TAT-VP3在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达,经GST标签纯化树脂纯化蛋白,并用PreScission Protease酶切除标签,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体。用ELISA进行效价检测,Western blotting鉴定其特异性。结果诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白,纯度大于90%,蛋白浓度为1.2mg/ml。制备了该蛋白的多克隆抗体,ELISA表明多克隆抗体效价为1：32000,Western blotting证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。     

GST-CML28融合蛋白的表达和纯化及多克隆抗体制备

本研究探讨GST-CML28融合蛋白的表达及抗体制备。CML28-pGEX-3X重组质粒转化BL21大肠杆菌,提取细菌蛋白后用GSTrap FF纯化柱进行纯化。将纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备CML28抗血清;免疫血清用CNBr-activated Sepharose 4B层析柱进行纯化,获得多克隆抗体。结果表明,获得的抗体能够满足针对CML28的ELISA、Western blot、免疫组织化学和量子点荧光检测的实验要求。结论:成功制备了高特异性,高效价的抗人CML28多克隆抗体,为今后深入研究其生物学功能提供了有用的实验工具。     

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定

目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。     

降钙素原的克隆表达及多克隆抗体制备

目的 克隆表达与纯化降钙素原(PCT),制备多克隆抗体,为其单抗制备及在临床上的应用研究提供有用的实验基础.方法 培养人甲状腺髓伴癌细胞株(TT细胞)提取总RNA进行RT-PCR获取PCT的全长基因,构建pET-PCT重组质粒,转化至DE3经IPTG诱导表达出融合蛋白,纯化并进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAG...     

Rheb1基因多克隆抗体的制备

目的:在大肠杆菌BL21中表达并纯化GST-Rheb1融合蛋白,以之免疫成年新西兰大白兔,获得Rheb1多克隆抗体。方法:运用PCR,限制性内切酶酶切及T4连接酶连接的方法,构建带有Rheb1基因的真核和原核表达载体;IPTG诱导GST融合蛋白高表达,通过皮下注射免疫新西兰大白兔,并取血清进行免疫印记分析抗体效价。结果:成功的制备了高效价的Rheb1兔多克隆抗体。结论:Rheb1多克隆抗体的成功制备,将为研究Rheb1基因的功能发挥重要的作用。     

人缺失型Midkine重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

目的获得兔抗人缺失型Midkine(t MK)的多克隆抗体,并将其初步应用于临床检测。方法将人t MK蛋白经亲和层析法纯化,并将其作为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗人血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗人t MK多克隆抗体,用免疫组织化学和蛋白印迹(Western blot)试验检测抗体的灵敏度和特异性。结果获得初步纯化的兔抗人t MK特异性多克隆抗体,该抗体能识别天然人t MK蛋白。结论制备的t MK多克隆抗体可初步用于临床检测。     

免抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景：凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白，它不仅具有氧化还原和电子传递功能，还具有促细胞凋亡功能，从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。目的：制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定。设计、时间及地点：单一样本观察，于200609／200808在新乡医学院免疫学研究中一心完成。材料：新西兰大白兔雌性2只，体质量1．9-2．1kg；JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司。食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者。抗原肽KLH由上海华大天源生物科技公司合成。CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司。方法：利用美国过敏和感染疾病研究所（NIAID）主办的抗原袁位分析网站（http：／／beta．immuneepitope．org／home．php）的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽，制备多克隆抗体并纯化。主要观察指标：采用间接ELISA、Westernblot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定。结果：间接EUSA法检测显示，血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1：128000。Westernblot结果显示，存在Mr67000条带。免疫组织化学检测结果显示，在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在，说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色。结论：实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体。     

兔抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景:凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用.目的:制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2008-08在新乡医学院免疫学研究中心完成.材料:新两兰大白兔雌性2只.体质量1.9～2.1 kg;JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司.食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者.抗原肽-KLH由上海华大天源生物科技公司合成.CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司.方法:利用美国过敏和感染疾病研究所(NIAID)主办的抗原表位分析网站(http://beta.immuneepitope.org/home.php)的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化.主要观察指标:采用间接ELISA、Western blot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定.结果:间接ELISA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1:128000.Western blot结果显示,存在Mr67000条带.免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色.结论:实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体.     

NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的原核表达载体,制备兔抗人NGAL多克隆抗体。方法利用DNA重组技术构建原核表达载体pET28a-NGAL,诱导表达NGAL融合蛋白,分离该融合蛋白后,注射入免疫家兔制备多克隆抗体。结果成功获得NGAL,免疫动物所得抗血清效价为1∶4000,该抗体能够识别原核表达的NGAL。结论成功克隆NGAL基因并制备了特异性的兔抗人NGAL多克隆抗体。     

白念珠菌CDRl和CDR2多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备特异性白念珠菌外排泵（CaCDRl和CaCDR2）的多克隆抗体,为研究CaCDRl和CaCDR2在介导白念珠菌耐药中的作用奠定基础。方法：利用Pfam网络预测程序和Blastn、Blastx程序设计引物．采用PCR法获得白念珠菌SC5314基因组上486bp长度的CDRl和CDR2目的基因,并将其克隆入pET-28a（＋）质粒,构建重组表达质粒后,转化人大肠埃希菌BL21宿主菌内,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达6xHis融合蛋白;经镍柱纯化蛋白后,免疫新西兰兔,制备兔抗多克隆抗体。用ELISA及蛋白印迹法检测该抗体的效价和特异性。结果：ELISA法检测所制备抗体的效价最终定为1：12800,工作浓度定为1：800;蛋白印迹法检测结果显示,抗体能与CaCDRl及CaCDR2蛋白特异性结合。结论：成功获得具有较高效价和良好特异性的CaCDRl、CaCDR2多克隆抗体．可用于白念珠菌CaCDRl、CaCDR2蛋白水平的鉴定。     

戊型肝炎病毒pb166-GST融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用谷胱甘肽S转移酶（GST）融合基因表达系统表达、纯化及鉴定HEVpb166-GST融合蛋白，为研制戊型肝炎诊断抗原探索新的途径。方法 由本室制备的重组大肠杆菌（E．coli）B121株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导HEVpb166-GST融合蛋白表达，用BDBiosience GST蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot对纯化的蛋白进行鉴定，并对实验条件和结果进行分析。结果 在LB培养液中的E．coliB121株能稳定、高效表达HEVpb166-GST融合蛋白；纯化后的成分单一，仅在43000处有表达，该蛋白能被GST特异性抗体识别。结论 我们的方法可获得高效的重组HEVpb166．GST融合蛋白，为进一步研制戊型肝炎诊断性抗原奠定了基础。     

GST-IRS-4原核表达载体的构建、表达及抗GST-IRS4多克隆抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4(insulinreceptorsubstrate4,IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗IRS4的多克隆抗体(pAb)。方法:从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出IRS4PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备pAb。Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果:酶切及测序鉴定证明,IRS4基因已正确插入到pGEX-Teasy中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44ku的融合蛋白。用Westernblot鉴定所制备的多克隆抗体可以与IRS4特异性结合。结论:IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)的结构和生物学功能奠定基础。     

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。     

人Tamm-Horsfall片段蛋白的表达及单克隆抗体的制备和鉴定

目的 构建人Tamm-Horfall蛋白（THP）抗原决定簇的原核表达载体,表达纯化重组人Tamm-Horfall片段蛋白并制备单克隆抗体.方法 将人Tamm-Horfall蛋白片段cDNA克隆至原核表达载体pET28a,经大肠杆菌表达、纯化,获得的Tamm-Horfll蛋白片段免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与sp2/0细胞融合,制备能产生THP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blot、ELISA、免疫组化等技术对制备的单克隆抗体进行鉴定.结果 原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达THP蛋白抗原决定簌的蛋白片段,用纯化的THP蛋白片段制备了鼠抗THP单克隆抗体.结论 成功制备了9株THP单克隆抗体,为进一步研究THP蛋白的分布、结构、功能及检测试剂盒的研发奠定了基础.     

促红细胞生成素多克隆抗体及酶标抗体的制备及纯化研究

目的以免疫亲和层析方法纯化重组人促红细胞生成素（rhEPO）并免疫新西兰家兔制备多克隆抗体,用辣根过氧化物酶标记抗体,为进一步建立ELISA检测体系做准备。方法购买rhEPO,用淋巴结内注射法制备多克隆抗体,EPO抗体与葡聚糖凝胶偶联,制成抗体亲和层析柱,以rhEPO作为抗原上样纯化。抗体先盐析粗提纯再过SPA亲和层析柱纯化。用高碘酸钠法制备酶标抗体。结果亲和层析纯化的抗原、抗体纯度较高,蛋白质含量测定分别为0.560、.41 mg/ml;酶结合率为0.578。结论免疫亲和层析法纯化rhEPO,制备的多克隆抗体及酶标记抗体的纯度好,可以满足下一步组建试剂盒的需求。