bcl-2重组腺病毒载体的构建

本研究目的在于构建 bcl-2的正义和反义重组腺病毒载体 ,以研究 bcl-2过度表达对周围神经损伤后脊髓前角运动神经元抗凋亡能力和对轴突再生的影响。为此 ,将正义和反义 bcl-2 c DNA克隆到腺病毒穿梭质粒 p Ad CMV,利用体内同源重组原理 ,用该重组质粒与 p JM17质粒共转染 2 93细胞 ,获得复制缺陷型重组腺病毒 Ad CMV/sense-bcl-2和 Ad CMV/antisense-bcl-2 ,其中 bcl-2 c DNA插入腺病毒基因组的 E1区 ,并由 CMV启动子控制。利用原位杂交、免疫组化反应鉴定重组腺病毒。结果显示 :从感染 Ad CMV/sense-bcl-2重组腺病毒的 2 93细胞中检测到 bcl-2的表达 ;重组腺病毒可感染 2 93细胞并在 2 93细胞内进行有效复制。从而表明本研究成功地构建了 bcl-2重组腺病毒 ,为进一步研究 bcl-2重组腺病毒的功能提供了条件     

腺病毒载体介导的LacZ基因在神经前体细胞的转染和表达

为了观察含报告基因 L ac Z的重组 5型腺病毒载体 ( Ad5CMVLac Z)在神经前体细胞转染和表达的量效关系并探讨用该载体构建基因修饰细胞的可能性 ,本研究用不同滴度 ( 1× 10 3～ 1× 10 1 0 PFU/ml)的 Ad5CMVLac Z转染体外培养的 SD胎鼠(胎龄 12 d)海马神经前体细胞 ,用β-半乳糖苷酶 (β-gal)免疫组化反应检测转染效率。结果显示 :当病毒滴度为 1× 10 7时 ,转染率约为 5 0 % ,当滴度增加到 1× 10 1 0时 ,转染率达 10 0 %。Ad5CMVL ac Z在神经前体细胞的转染率具有滴度依赖性的量效关系。表明高滴度的 Ad5CMVLac Z成功地转染了大部分神经前体细胞 ,Lac Z基因也得到充分表达。提示神经前体细胞是该载体转染的适宜靶细胞 ,并有可能通过该载体转导目的基因 ,构建出基因修饰细胞     

bcl-2基因在免疫系统中的作用

bc1-2是在滤泡型淋巴瘤中最先发现的与t(14;18)染色体易位相关的一种癌基因。最近研究表明,bc1-2对细胞凋亡具有调控作用,并与T细胞发育、B细胞分化以及淋巴瘤的发生、发展等方面有关。     

腺病毒载体介导BMP-2基因修复骨缺损的研究进展

腺病毒载体(Adv)介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)转基因方法被认为是目前最有效的转基因诱导成骨修复骨缺损的方法之一。进一步改造腺病毒载体,降低免疫原性,提高基因治疗的安全性,已成为目前研究工作的重点。在参考大量的相关文献基础上,现就腺病毒载体基因治疗骨缺损的研究概况、宿主免疫应答问题以及解决方案几个方面,对介导BMP-2基因修复骨缺损的腺病毒载体的研究进展作一综述。     

GDNF基因体内转染对大鼠面神经运动神经元的保护作用

目的：研究GDNF基因体内转染对大鼠面神经损伤后运动神经元的保护作用，为基因治疗周围神经损伤提供依据。方法：用脂质体介导pEGFP-GDNFcDNA基因转染受损面神经所支配的面肌，荧光显微镜和免疫组化法分别检测面肌和面神经运动神经元内GDNF的表达。计算损伤侧面神经元的存活率。结果：转染侧面肌细胞内有绿色荧光。面神经损伤后的第7、14、21和28d时间段，对照组面神经运动神经元的存活率分别为93．06％、76．06％、72．38％和70．69％，转染组分别为94．00％、84．00％、79．25％和78．06％。转染组面神经运动神经元GDNF的表达高于对照组。结论：面神经损伤后经脂质体介导GDNF基因体内转染靶器官后，对受损面神经运动神经元有保护作用。     

腺病毒介导IFN—γ基因转染的瘤苗体内抗肿瘤转移作用

通过缺陷型腺病毒载体的介导将小鼠ＩＦＮ－γ基因转染入肿瘤细胞，经５０００ｒａｄ＾６０Ｃｏ照射后射备成瘤苗，观察其对实验性肺转移荷瘤小鼠的治疗效果，并对其治疗作用的免疫要现进行了研究。结果显示：经ＩＦＮ－γ基因转染瘤苗治疗后小鼠脾淋巴细胞诱导的ＣＴＬ，ＬＡＫ及腹腔巨噬细胞杀伤活性均明显升高。     

腺病毒载体介导的ING4基因对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用

目的:用人源化改造的鼠肿瘤生长抑制因子(mING4)基因构建的腺病毒表达载体(Ad-ING4)研究对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用.方法:以pcDNA3.0-mING-4重组质粒为模板,通过基因定点突变技术对mING4基因进行人源化改造,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人ING-4氨基酸序列相同的重组腺病毒子(Ad-ING4),感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING4在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞技术检测ING4基因表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;荧光共聚焦显微镜观察MG-63细胞凋亡的形态学变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因表达对MG-63细胞巾的Bax、Bcl-2基闪表达的影响.结果:基因测序和PCR分析结果显示,人源化改造的小鼠ING4分子氨基酸序列与人ING4分子完全相同,成功构建了Ad-ING4腺病毒表达载体,在MG-63细胞中ING4基因的表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,出现典型细胞凋亡形态学变化,ING4基因表达可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡.结论:转染ING4基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2表达水平来发挥抗肿瘤作用的.     

腺病毒载体介导的人IL-24基因对HL-60白血病细胞体外培养的影响

目的 构建人IL-24的腺病毒载体Ad-IL24,观察Ad-IL24对HL-60细胞体外培养的影响.方法 以pcDNA3.0-IL24重组质粒为模板PCR扩增IL-24基因,酶切并连接到带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的pAdTrack-CMV质粒上,Pme Ⅰ线性化重组质粒pAdTrack-CMV-IL24,并与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL24,经Pac Ⅰ线性化后转染QBI-293A细胞,收获重组病毒Ad-IL24.将它感染HL-60细胞,通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)、MTT和流式细胞术(FCM)法检测IL-24对HL-60细胞生长的影响,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变,ELISA检测重组病毒对HL-60细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响.结果 成功构建重组腺病毒载体pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL24并获得高滴度的重组腺病毒Ad-IL24,各种检测方法表明IL-24基因能抑制HL-60细胞生长,诱导凋亡,IL-24还能下调HL-60细胞Bcl-2的表达并刺激它分泌二级细胞因子IFN-γ和TNF-α.结论 IL-24能抑制HL-60细胞生长、诱导凋亡,它可通过下调HL-60细胞Bcl-2的表达并刺激其分泌具有抗肿瘤活性的二级细胞因子来发挥效应.     

腺病毒介导的T-bet基因转染诱导Th1型淋巴细胞分化

目的：构建含有T细胞转录因子T-bet(T-box expressed in T cells)的重组腺病毒Ad.T-bet，并诱导Th1型淋巴细胞分化。 方法： 采用RT-PCR的方法从健康人外周血淋巴细胞的总RNA中克隆T-bet基因，亚克隆入腺病毒穿梭载体成为pAdtrack-CMV.T-bet，与腺病毒基因组载体pAdeasy-1同源重组为pAd.T-bet，经Pac I酶切后转染293细胞，用 Western blotting 和RT-PCR的方法鉴定Ad.T-bet；联合腺病毒和脂质体以感染倍数(m.o.i) 5000感染活化的淋巴细胞，用ELISA 法检测培养液中IFN-γ含量。 结果： 采用RT-PCR方法从健康人外周血淋巴细胞中扩增出T-bet基因，构建出重组腺病毒Ad.T-bet，Western blotting 和RT-PCR均检测出细胞内T-bet蛋白表达；联合Ad.T-bet和脂质体感染淋巴细胞诱导Th1型细胞因子IFN-γ持续高表达。 结论： 重组腺病毒Ad.T-bet有效诱导Th1型细胞分化，有望成为改变肿瘤患者免疫抑制状态的有效方法。     

腺病毒介导MOMP基因转染对树突状细胞免疫功能的影响

目的 探讨腺病毒(Ad)介导E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因转染对树突状细胞(DC)的表型及体内免疫功能的影响.方法 用小鼠重组粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)从小鼠骨髓干细胞中诱导培养DC,并用大肠杆菌脂多糖(LPS)促进DC的成熟,流式细胞仪检测DC表型.用不同感染滴度(MOI)的含增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组Ad转染DC,荧光显微镜下观察EGFP的表达细胞百分率,选择最佳MOI;用最佳MOI的含MOMP基因的重组腺病毒(Ad-MOMP)转染DC,流式细胞术检测转染前后DC表型变化,并用活细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖的能力;ELISA检测转染前后DC分泌细胞因子及DC、T细胞共同培养上清中细胞因子的水平.Ad-MOMP转染DC经尾静脉免疫小鼠,ELISA检测其脾脏淋巴细胞分泌的细胞因子.结果 诱导的DC形态典型,表面高表达CD11c、MHCⅡ类分子,中度表达CD80分子.MOI=1000为重组Ad转染DC最佳滴度,此时90%以上的DC表达荧光,Ad-MOMP转染DC后能检测到MOMP的表达.Ad-MOMP转染对DC表面的特征性表型CD11c无影响,而CD80及MHCⅡ表达上调;转染后的DC分泌大量IL-12,具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,并刺激T细胞分泌大量IFN-γ.Ad-MOMP转染DC后尾静脉免疫小鼠,其脾细胞产生高水平的IFN-γ.结论 Ad载体能介导外源MOMP基因在DC中的表达,Ad-MOMP转染DC后MOMP基因的表达能增强DC抗原提呈功能,促进DC活化,转染后的DC与T细胞共孵育能诱导T细胞向TH1细胞分化,体内实验表明Ad-MOMP转染DC能诱导衣原体特异性TH1反应.这为Ad-MOMP转染的DC疫苗用于免疫治疗提供了理论依据和技术基础.     

重组腺病毒介导GDNF基因在多种细胞的高效转移和表达

用作者等所构建的重组腺病毒AdCMVgdnf直接感染多种细胞系和大鼠中脑原代神经元细胞，多重感染复数为20PFU／ml。采用免疫组织化学染色方法检测GDNF表达，观察所构建的GDNF重组腺病毒在各种细胞中介导GDNF基因转移和基因表达的能力。结果表明在一系列神经细胞或非神经细胞中，GDNF重组腺病毒均可介导GDNF基因的高效转移和表达。提示GDNF重组腺病毒可作为帕金森氏病基因治疗的高效基因转移载体。     

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。     

人TH基因重组腺病毒的构建及生物学活性研究

将人酪氨酸羟化酶cDNA表达盒克隆于质粒型腺病毒载体p△Elsp1A，得到重组质粒pAd－TH。随后用脂质体法将重组质粒pAd－TH和拯救型腺病毒质粒pBHG11一起共转染293细胞，通过体内同源重组生成重组腺病毒AdCMVth，THcDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。采用形态学、病毒核酸酶切和PCR／RT－PCR等方法进行鉴定正确。重组腺病毒滴度达到1010pfu／ml。初步结果表明，该重组腺病毒感染MN9D细胞后可使细胞内多巴胺水平增加1倍，显示出明显的TH生物学活性。提示TH重组腺病毒AdCMVth可作为高效的基因转移载体用于帕金森氏病基因治疗。     

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。     

腺病毒载体介导的lacZ基因在NG细胞系及大鼠黑质的表达

本实验用标记基因ｌａｃＺ５型重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ）转染培养的ＮＧ细胞系，Ｘ－ｇａｌ染色检测转染效率．在培养的ＮＧ细胞系，当病毒滴度为２×１０８时，转集率达到５０％，当滴度为２×１０９时，转染率达１００％，有较好的量效关系；固定病毒液度为１０１０，培养２～１６ｈ，细胞的转染率随时间延长而提高，有较好的时效关系。将Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ注射到大鼠黑质部位后，分别于注射后３～１２０ｄ取脑、切片、Ｘ－ｇａｌ染色，发现黑质局部从第７ｄ开始有部分蓝染，第１０ｄ达高峰，注射局部感染率１００％；９０ｄ时开始下降，持续至１２０ｄ；纹状体等其它部位无蓝染．上述结果提示，腺病毒载体介导的标记基因可在培养的神经细胞系和中脑黑质部位高效表达，为进一步开展中枢神经系统退变性疾病尤其是帕金森氏病的基因治疗奠定基础。     

rIL－6抗癌机理初探（Ⅱ）：rIL－6对小鼠LAK细胞体内外调节效应

为探讨ｒＩＬ－６对ＬＡＫ细胞的调节效应，进行了ｒＩＬ－６对小鼠脾脏ＬＡＫ细胞功能影响的体内外实验研究。实验采用Ｃ_（５７）ＢＬ／６荷瘤或正常小鼠，给予ｒＩＬ－６或生理盐水，１５ｄ后取小鼠脾细胞诱导活化后进行ＬＡＫ杀伤功能测定。结果表明①ｒＩＬ－６在体外对ＬＡＫ杀伤活性有明显的促进作用并在一定范围内呈剂量反应关系；②体内注射ｒＩＬ－６后对正常鼠和荷瘤鼠ＬＡＫ细胞的诱导及杀伤活性均有促进作用；③荷瘤对正常鼠ＬＡＫ细胞功能有抑制作用，而ｒＩＬ－６对荷瘤所致ＬＡＫ细胞功能下降有一定的预防作用。提示ｒＩＬ－６对小鼠脾脏ＬＡＫ细胞杀伤活性的促进效应可能是ｒＩＬ－６发挥抗癌作用的一个途径。     

外源基因在人造血干祖细胞中的转移和表达

应用逆转录病毒载体介导基因转移法将ｎｅｏ~ｒ基因导入人造血干祖细胞，并经体外液体长期培养。结果表明，产重祖病毒细胞ＰＡ３１７／Ｎ２的病毒滴度最高达６．５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ，用ＰＣＲ法从体外培养２、４、６ｗ及加入ｒＩＬ－１、ｒＩＬ－６的悬浮和贴壁的转染细胞中均可扩增出ｎｅｏ~ｒ基因ｃＤ－ＮＡ片段，非同位素化学发光法标记ｎｅｏ~ｒ探针与之杂交显示阳性结果。表明逆转录病毒介导目的基因已有效地转入体外培养的人造血干祖细胞中，并进行表达。     

低氧预处理对大鼠海马神经元缺氧耐受性和bcl-2表达的影响

采用免疫组织化学方法观察了低氧预处理对大鼠海马神经元缺氧耐受性和 bcl-2表达的影响。结果显示 ,经低氧预处理的海马神经元缺氧 -复氧后 bcl-2表达较对照组明显增强 ,神经元损伤程度减轻 ,神经元存活数明显高于对照组。本结果表明 ,低氧预处理可使海马培养神经元对缺氧产生耐受 ,增加缺氧 -复氧后神经元 bcl-2的表达。提高神经元存活数