产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对O1群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。 方法根据O1群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因rfb-O1和霍乱肠毒素的A亚基编码基因ctxA的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用便携式Smartcycler Ⅱ实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性。 结果实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌的检测敏感度为1．0×10^2拷贝每反应体系;对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1．0×10^1 pg每反应体系;该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2h内完成。 结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力。     

产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.     

实时定量PCR快速检测O1群和O139群霍乱弧菌

根据O抗原的不同，霍乱弧菌可分成200多个血清群，其中仅O1群和O139群能引起暴发流行。霍乱弧菌的检验多以传统细菌培养方法为主，存在操作繁琐、费时费力等缺点。实时PCR以其闭管检测、无需电泳、特异性强、灵敏度高、可定量等优点已广泛用于病原菌的检测，其中包括致病性弧菌的检测，如霍乱弧菌、     

霍乱弧菌PCR快速检测及应用研究

霍乱弧菌快速、准确的检定是控制霍乱流行的重要手段。本研究建立了ｃｔｘＡ－ＰＣＲ快速检测鉴定方法，并用于新疆霍乱弧菌Ｏ１３９腹泻暴发的病人诊断和环境水体的污染状况评价，取得了较理想的效果。该方法灵敏度高、特异性好、被扩增样品中含４个以上活菌细胞即可检出，为霍乱防治和分子流行病学研究提供了又一有效手段。     

O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗O1群小川型霍乱弧菌(VibriocholeraeO1serotypeOgawa)特异性单克隆抗体(McAb),为霍乱的早期快速诊断提供有力的抗体工具。方法以灭活的O1群小川型霍乱弧菌免疫Balbc小鼠,通过杂交瘤技术制备针对O1群小川型霍乱弧菌的McAb,以间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行筛选,分析其亚类,检测其效价及相对亲和力,以间接ELISA和Westernblot鉴定McAb特异性,并进行McAb结合表位分析。结果融合了602株能分泌抗O1群小川型霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株,最后得到5株能稳定分泌特异性的针对该McAb的细胞株,其抗体亚类分别为3株IgG1,1株IgG2b,1株IgG3;腹水效价均达1×10-6;亲和常数在1×108～1×109之间。间接ELISA法及Westernblot证实所获的McAb可与O1群小川型霍乱弧菌发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示除有2株McAb识别相同的抗原表位外,其余均识别不同的抗原表位。结论获得霍乱弧菌O1群小川型特异性McAb,为O1群小川型霍乱早期快速诊断和发病机理的研究提供基础。     

甲肝病毒特异性TaqMan荧光定量PCR法检测甲肝病毒核酸的研究

目的 建立甲肝病毒(HAY)特异性TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对血清等样品中的HAV进行检测.方法 根据参考文献,选取HAV基因组保守区5'-NCR区引物和探针,建立特异性强、敏感度高、稳定性好的TaqMan HAV Real-time RT-PCR检测体系并应用于甲肝患者血清等病毒核酸的检测.结果 本研究建立的方法能够特异检测出样品中的甲肝病毒,其灵敏度介于每反应0.1CCID50至0.01CCID50之间.同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大2.0％,批间样本Ct值的变异系数最大2.6％.急性期甲型肝炎患者血清中甲肝病毒为5.18×102～4.93×107拷贝/ml.结论 本实验建立的HAV Real-time RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,可成功应用于临床样本等甲肝病毒的病原学检测.     

霍乱弧菌O1群和O139群NhaA基因的克隆和变异性研究

霍乱弧菌是一种嗜盐性细菌 ,可在较宽盐浓度和ｐＨ值范围内生长 ,Ｎａ /Ｈ 离子交换泵与此密切相关。ＮｈａＡ基因所编码的ＮｈａＡ蛋白是维持该离子交换泵必需的功能蛋白。ＮｈａＡ基因的变异可使霍乱弧菌适应不同的外环境而得以生存。为了解我国霍乱弧菌Ｏ1群和Ｏ1 3 9群ＮｈａＡ基因的变异性与致病性的关系 ,我们采用ＰＣＲ和序列分析的方法 ,对来源于我国广东省和内地部分省份的 4 0株霍乱弧菌 (包括Ｏ1群和Ｏ1 3 9群 )ＮｈａＡ基因进行克隆和序列比较分析。根据霍乱弧菌Ｏ1群野毒株ＮｈａＡ基因序列 ,设计扩增引物序列为 :上游5′ ＣＣ…     

B型流感病毒Yamagata系和Victoria系双重荧光PCR诊断方法的建立与应用

目的 建立一种新型的双重荧光PCR诊断方法,用于B型流感病毒By (B/Yamagata)和Bv(B/Victoria)亚系的准确分子分型.方法 从GenBank随机下载By和By HA(hemagglutinin)基因各50条序列,通过MEGA分析,利用Primer Primer软件设计亚系特异性引物和通用探针,建立双重荧光PCR诊断方法.用HAI(hemagglutination inhibition)实验确认的B型流感病毒亚系分离毒株和A型流感病毒进行特异性验证,用体外转录核酸拷贝数进行灵敏度实验.结果 2006-2010流感监测年份,对17 765份流感样病例咽拭标本中分离到B型流感病毒793株,本方法鉴定有152株By和641株Bv病毒,与HAI鉴定结果一致.本诊断方法的检测特异性达100％,灵敏度达102拷贝/μl,重复性变异系数＜3.5％.结论 本研究所建立的荧光PCR方法为流感实时监测提供了有力的技术支撑,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.     

人类疱疹病毒6型荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立人类疱疹病毒6型(HHV-6)荧光定量PCR检测方法,并检测临床样本.方法 根据文献合成HHV-6 U65-66基因片段的特异性引物和TaqMan探针,构建质粒制备标准品,评估该方法的特异性、灵敏度和重复性;并用该方法检测93份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本.结果 本实验检测HHV-6的灵敏度为3×10(0)拷贝/μl;标准曲线间线性关系(R2)为0.999,扩增效率为97.9％;同一样本重复检测3次,组内Ct值的变异系数最大为0.61％,组间为3.13％;特异性检测中只有HHV-6阳性标本出现扩增曲线.93份临床标本中检出HHV-6阳性2例,检出率为2.15％.结论 本实验所建立的荧光定量PCR检测HHV-6的方法特异强、灵敏高、重复性好,具有应用于临床检测的潜在价值.     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

脑心肌炎病毒 TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立脑心肌炎病毒（ EMCV） TaqMan real-time PCR检测方法。方法根据GenBank中公布的EMCV 3D基因保守区段设计并合成1对引物和1条TaqMan 探针,建立EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,且对体系进行优化;对该法进行灵敏性、特异性验证;采用建立的方法对98份猪血清样本进行检测,并与ELISA结果进行比较。结果建立的EMCV TaqMan real-time PCR检测方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0．995;灵敏性比普通PCR高100倍,且仅能特异性检出 EMCV;对猪血清样本的检测与 ELISA 法检测结果符合率为98．0％。结论已建立了EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,该法灵敏性高、特异性好,可用于EMCV的检测及定量分析。     

TaqMan real-time PCR assay based on DNA polymerase gene for rapid detection of Orf infection

Both conventional and real time PCR (rt-PCR) assays based on the amplification of a 103bp fragment from the DNA polymerase (DNA pol) gene (conserved, non-structural) of Orf virus (ORFV) were developed for detection and semi-quantitation of ORFV DNA from infected cell culture and clinical samples. The latter technique was based on TaqMan chemistry. The rt-PCR assay was specific and sensitive as it could detect as low as 3.5fg or 15 copies of ORFV genomic DNA. Both intra- (0.38-1.0%) and inter-assay (0.53-2.87%) variabilities of rt-PCR were within the acceptable range meaning the high efficiency and reproducibility of the assay. The rt-PCR was applied successfully to detect ORFV DNA from suspected clinical samples. Further, the assay has shown a relative diagnostic sensitivity and specificity of 100% and 93.5%, respectively, when compared to B2L gene based semi-nested PCR implying a wide potential of this rt-PCR for rapid field diagnosis of Orf in sheep and goats.     

Biotype-specific probe for Vibrio cholerae serogroup O1.

The O1 serogroup of Vibrio cholerae can be divided into two biotypes, El Tor and Classical. Current tests to distinguish between these biotypes are often difficult to interpret. On the basis of the difference in sequence of the hlyA gene in these biotypes, we have developed a simple probe that can easily and reliably differentiate between the two biotypes.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.     

应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测O139群霍乱弧菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物(2条内引物、2条外引物);优化LAMP反应条件和反应体系,对反应体系中的引物、dNTP、Mg2+/Mn2+离子及Calcium等浓度进行优化;并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测,验证该方法的特异性;通过肉眼目测或电泳检测比较结果.结果 所有O139群霍乱弧菌经LAMP榆测均呈绿色并电泳有阶梯状条带为阳性,O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性;该体系最低检测限为63 CFU/反应;检测结果在白光下通过肉眼即可判断;从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.结论 本研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌,无需昂贵的仪器,简单方便,非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用,值得推广.