正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法

胃黏膜上皮细胞是进行胃生理功能、病变机制、药物治疗等研究的重要工具，已被广泛应用于科学实验。原代培养细胞能反映原始组织的特点，与体内姊妹细胞的生理状态相似，是进行相关研究的理想材料。但胃黏膜上皮细胞对内环境要求较高，分离纯化后并不象肝细胞等易于存活和生长，不少实验因这一环节而不能进行下去，不得不采用从肿瘤组织衍生的各种细胞株，此类细胞株与正常胃黏膜上皮细胞在生长特性、形态结构等方面存在较大差异，不能代表正常胃黏膜上皮。在我国，几乎所有的相关研究都是采用各种细胞株，因此本文较详细全面地介绍了文献报道中较成功的正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法，以期对相关研究有所帮助。     

一种简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法

背景：原代培养的人正常胃黏膜上皮细胞与体内姊妹细胞相似，是进行胃生理和病理研究的理想工具，但我国尚未见简便、可靠的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法的报道。目的：探讨简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法。方法：以胶原酶Ⅱ和分散酶磁性搅拌分离人正常胃黏膜上皮细胞。以甲基噻唑基四唑（M1Tr）比色法检测细胞活力，以观察细胞大体生长过程；以溴脱氧尿苷（BrdU）标记法检测S期细胞数量，以观察细胞微观增殖能力。以PAS染色鉴定胃黏膜上皮细胞黏原颗粒；以细胞角蛋白（CK）-18免疫荧光染色鉴定上皮细胞。以光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态结构。初步观察传代细胞的贴壁生长情况。结果：培养第2～3d．胃黏膜上皮细胞活力增幅最大．第4d达最高点，之后逐渐下降；BrdU孵育18h后，33．3％的细胞处于和曾经处于S期。接种密度高时，细胞PAS染色均呈紫红色，可见细胞核旁黏原颗粒；接种密度低时，仅成团细胞PAS染色呈阳性；培养第3d，绝大部分细胞CK-18阳性。接种第2d，胃黏膜上皮细胞成团簇状生长，增殖迅速，第4d后逐渐停止生长．第5d开始出现漂浮死亡细胞，最终完全被成纤维细胞取代；透射电子显微镜可见微绒毛、分泌颗粒、连接复合体等上皮细胞特征。传代胃黏膜上皮细胞增殖、铺展能力较原代细胞降低。结论：磁性搅拌酶分离培养可得到数量多、纯度高的人正常胃黏膜上皮细胞。     

大鼠系膜细胞系的建立及鉴定

大鼠系膜细胞系的建立及鉴定梅长林张黎明陈蕾关键词系膜细胞系低氧鉴定中图法分类号Ｒ３２９．２５肾小球系膜细胞有多种生理功能，在肾小球疾病的发生、发展中起着重要作用〔１〕。长期以来，原代培养的大鼠系膜细胞一直是研究肾小球疾病发病机理的最常用细胞模型。然而...     

线粒体DNA变异在大肠癌发病中的作用与机制研究

目前认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，而且与核外线粒体DNA的改变也可能有重要的关系。为研究线粒体DNA的变异在大肠癌发病中的作用与机制，本文对4株大肠癌细胞系和1株原代培养的正常肠上皮细胞的线粒体DNA的D-环区进行了对比研究。     

神经母细胞瘤体外细胞系的构建方法

目的 对神经母细胞瘤(NB)进行体外培养，探讨神经母细胞瘤(NB)体外建系的方法。方法 NB患儿新鲜手术标本，采用组织块培养法、酶消化培养法建立原代细胞系；用选择性酶消化法和机械刮除法进行细胞纯化；从细胞形态学、神经特异性烯醇化酶染色、软琼脂克隆形成实验三方面对细胞进行初步鉴定，证实所培养细胞是否为NB细胞。结果 两种细胞培养法均可培养出NB细胞，纯化后可得形态均一的细胞系。结论 可采用适当的细胞培养方法建立神经母细胞瘤的体外细胞系。     

胰岛细胞系研究进展

由于细胞分化不完全及表型不稳定,目前仍没有非常适合代替原代胰岛β细胞进行功能研究用的细胞系。已经建立的胰岛细胞系主要分两类:动物胰岛β细胞瘤起源的细胞系(如RIN、INS细胞系)和人β细胞起源的细胞系,各种细胞系的生物学特征方面各不相同,但都保留了某些正常胰岛细胞功能特征。采用基因工程的方法和挑选更优越的亚系是目前改善细胞系功能的主要手段。     

胃癌细胞系SGC7901通过间充质干细胞原纤毛调控钙信号对成骨分化的影响

目的 探究胃癌细胞系SGC7901如何影响间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化。方法 分离SD大鼠乳鼠股骨,获取原代MSCs。将原代MSCs和经血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)处理的原代MSCs分别与胃黏膜细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC7901共培养,并以成骨诱导培养基(OS培养基)诱导72 h,提取MSCs总蛋白和总RNA。对总RNA进行RNA-seq检测并对显著差异基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)和真核直系同源群(euKaryotic Ortholog Groups, KOG)可视化分析;以GAPDH为内参,Western blot检测成骨标志蛋白,钙信号相关蛋白和原纤毛结构相关蛋白表达;对共培养后获取的MSCs总蛋白进行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)活性检测。结果 MSCs原代培养细胞呈多角形或梭形;经过成骨诱导培养基(OS培养基)诱导,茜素红染色矿化结节呈红色;以SGC7901为对照,MS...     

不同细胞系制备甲型肝炎病毒抗原效果的比较

甲型肝炎（ＨＡＶ）以在原代人胚肾细胞、原代非洲猴肾细胞、人成纤维细胞（人胚肺二倍体细胞）和传代猴胚肾细胞（Ｖｅｒｏ、ＦＲｈｋ４）等细胞中进行增殖和传代。但为了满足ＨＡＶ临床诊断所需，大量扩增ＨＡＶ，应用原代细胞和二倍体细胞是难以做到的。因此，我们选用ＦＲｈｋ４和Ｖｅｒｏ２个传代细胞系增殖传代的特性进行了比较，而且对常规传代细胞培养法和转鼓培养法生产ＨＡＶ抗原进行了比较，从而形成了稳定的细胞传代毒种及收获保存方法，达到获得大量ＨＡＶ抗原的目的。结果如下。（一）材料和方法１．ＨＡＶ龙甲－１株从急性甲…     

肺腺癌细胞系H114的建立

目的建立国人男性肺腺癌细胞系,为肺癌的防治研究提供理想的体外实验模型。方法以经组织学和／或细胞学确诊的标本进行原代培养,通过光镜观察、细胞苏木精．伊红（HE）染色、细胞生长曲线、异体移植实验及组织HE染色等对其进行分析鉴定,建立细胞系。结果细胞经液氮罐或-80℃低温冰箱反复冻存复苏后仍保持良好的增殖活性,复苏细胞经0．4％胎盘蓝染色,活细胞比率均保持在85％以上。在整个168h的观察时间里,肺腺癌H114细胞始终处于持续增殖状态,可见潜伏期和指数生长期,由于本细胞系传代次数较少,生长活跃,7d还没出现平顶期和退化衰亡期;体外培养细胞生长稳定,细胞形态学及浸润性生长结果表明该细胞系符合恶性细胞特性,裸鼠接种成功致瘤,瘤细胞形态与原患者的病理切片相似,命名为H114细胞系。结论该细胞系符合建系标准,是一株新建的人肺腺癌细胞系。     

miRNA-216b通过靶向调控Beclin1对顺铂诱导的胃癌细胞自噬及凋亡的影响

目的:探究miRNA-216b(miR-216b)对顺铂处理的胃癌细胞的影响及其可能的作用机制.方法:体外培养人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP,将SGC7901/DDP细胞随机分为空白对照组、agomir-NC+ oe-NC组、agomir-miR-216b...     

NG108-15细胞系作为小鼠神经内分泌细胞模型的适合性

目的探讨NG108-15细胞系作为小鼠神经内分泌细胞模型的适合性。方法培养NG108-15细胞,大鼠及小鼠的下丘脑原代,观察其7 d后细胞生长情况,利用大鼠和小鼠的多个与神经内分泌有关的基因序列设计了两组不同的引物对该细胞系的总RNA进行基因扩增分析,试图分析该细胞系在基因表达水平的差异,以确定该杂合细胞在神经内分泌相关研究中的适合性。结果 7 d后三类细胞均有神经元的突触分化,但NG108-15细胞体积较大,成分散生长。大鼠和小鼠的原代培养细胞,则体积较小,细胞成簇生长,细胞间有明显的突触联系。荧光定量PCR显示,β-actin的扩增在两组细胞内扩增正常且无差异,说明两组细胞的起始模板量相等。但剩余的所有基因却只能在大鼠原代细胞中正常扩增,而在NG108-15细胞却扩增失败。所有基因均能在NG108-15细胞和小鼠原代细胞中进行扩增,且扩增效率无明显差异。所有来自小鼠的引物序列扩增正常,而来自大鼠的引物序列则除了内参基因β-actin扩增正常外,其他均扩增失败或扩增效率低下。结论在神经内分泌失调的研究中,该杂交瘤细胞更适合与小鼠动物的研究结果相对应。     

体外培养蚊细胞的生长条件及蚊细胞系的建立

蚊细胞系的建立对于深入研究蚊及其传播的病原体具有重要意义。二十多年来,国内外已从十多种蚊建立了近四十个细胞系。本文对体外培养蚊细胞的生长条件及建立蚊细胞系的方法作了概述。蚊细胞在体外的生长需要碳水化合物(常用葡萄糖,或果糖、海藻糖等)、脂类(固醇、脂肪及脂肪酸等)、氨基酸(较蚊本身需求更多,包括15种必需氨基酸)及其它微量物质等营养成分,同时也需要相对稳定的渗透压及适宜的温度和pH值。在培养细胞的标准化方面,目前倾向于以化学成分明确的哺乳类细胞培养基取代化学成分不明确的无脊椎动物细胞培养基,以无血清或低血清培养基取代含血清的培养基。目前,蚊细胞系的建立及保存已成为标准化的技术程序。在原代培养阶段,合理选择消毒剂及消毒时间,尽量使组织少受伤害而保持最大活力,是细胞系建立的关键。传代可根据不同蚊种的不同组织细胞采用机械吹打或胰酶消化法分散细胞。冷冻蚊细胞一般以含10～20％保护剂(二甲基亚砜或甘油)的培养基制备细胞悬液(200～600万个细胞/毫升),保存于液氮(-196℃)中。通过快速升温复苏。     

维甲酸对贮脂细胞RAR、cAMP含量的影响

应用放射配基结合分析技术测定原代培养大鼠贮脂细胞维甲酸受体（RAR）含量及维甲酸（RA）对原代大鼠贮脂细胞RAR含量的影响；用放射免疫分析法测定RA，维生素A棕榈酯（RP）对原代培养大鼠贮脂细胞cAMP含量的影响。结果显示贮脂细胞RAR明显减少，RA作用48h，贮脂细胞RAR含量升高，原代培养的贮脂细胞经RA、RP作用48h后，细胞cAMP含量增加。结果提示RA调控细胞增殖，胶原蛋白合成是通过恢复贮脂细胞RAR含量，改变细胞信号系统，进而调控相应基因表达而实现的。     

永生化肝细胞系研究进展

衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特性。从动物或人的组织细胞取材培养，体外经过第一次传代后的具有增殖能力的细胞群体称为细胞系。一些细胞系在体外有一定寿命，只能有限期传代，一般不超过50代，称为有限细胞系；另一类体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力、可以无限传代的细胞系称为永生化细胞系。     

ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化的实验研究

目的 观察不同浓度全反式维甲酸(ATRA)体外对自建神经母细胞瘤(NB)细胞系细胞增殖抑制和形态分化的影响。方法 取住院手术的NB患儿的新鲜标本，进行原代细胞培养，并对培养的细胞进行分离与纯化，建立细胞系，作为细胞模型。通过台盼蓝拒染计数活细胞，用倒置相差显微镜观察加药处理前后细胞形态学变化。结果 5μm／L、20／μm／L，ATRA作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并对体外增殖有抑制作用。结论 所建立的NB细胞系为可诱导分化型(即N型)，ATRA能抑制细胞增殖并诱导其分化，而且有剂量依赖关系；5μm／L，ATRA对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化。     

大肠癌细胞线粒体DNA D-环区的突变

目的研究线粒体DNAD-环区在大肠癌细胞中的突变情况。方法用PCR与直接测序相结合的方法．对比分析三株大肠癌细胞系和一例原代培养的正常肠上皮细胞的线粒体DNAD-环区的突变位点。结果三株大肠癌细胞系和正常肠上皮细胞的线粒体DNAD—环区均存在不同程度的点突变，其中72位C→T，73位A→G，16298位C→T，16519位T→C这4个突变位点在3株癌细胞和正常肠上皮细胞中均可检测到。在SW480和Lovo细胞中检测到16224位T—c、1631l位T—c两个相同的突变位点，在SW480和HT29中检测到114位C→T、498位C→T、16234位C→T 3个相同的突变位点．不同大肠癌细胞系中相同的突变位点考虑为细胞的特征性改变。结论大肠癌细胞线粒体DNAD-环区具有多态性和特征性突变，细胞特征性的突变可能与大肠癌患者的易感性有关。     

肝细胞对星状细胞凋亡的影响和复方861的干预作用

目的：研究肝细胞对星状细胞凋亡和影响中药复方861的干预作用。方法：体外采用分离培养的正常大鼠原代肝细胞和星状细胞系,将培养的肝细胞和复方861作用于不同的培养基再作用于星状细胞,用电镜观察和流式细胞仪检测细胞凋亡。临床研究对象是用复方861治疗6个月行治疗前后肝穿的慢性乙型肝炎病人。结果：原代培养的正常肝血细胞促进了星状细胞的凋亡（P＜0．05）。复方861可以增加这种促凋亡作用（P＜0．05）。临床研究显示慢性乙型肝炎患者肝星状细胞大量活化增生,用复方861治疗6个月后有肝细胞再生,同时活化的星状细胞数量显著减少,可观察到其凋亡。结论：正常肝细胞可以促进星状细胞凋亡,复方861对星状细胞有直接和间接的促凋亡作用。     

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的　建立人源性肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法　利用SV4 0LTag基因和真核表达载体pcDNA3.1( - )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果　经G4 1870 0～30 0 μg/ml筛选 ,4 2d后获一抗G4 18肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌白蛋白 (ALB)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)及乳酸脱氢酶 (LDH)的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经逆转录聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹检测 ,转染肝细胞的ALBmRNA阳性和细胞色素P4 5 0 2E1阳性。结论　新建人源性肝细胞系与原代培养肝细胞具有类似的形态学特征和生物学功能     

小鼠主动脉平滑肌细胞培养及钙化模型的优化

目的 通过改良后的酶消化法进行小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）原代培养，提高VSMCs原代培养效率及质量，进而建立更快速有效的体外钙化模型。方法 剥离小鼠主动脉中膜并将其剪碎，分别采用改良组织贴块法及改良酶消化法进行小鼠VSMCs原代培养，免疫荧光染色鉴定细胞纯度后，分组（经典钙化组、改良钙化组）进行体外钙化诱导，采用vonKossa染色法评估各组钙化差异。结果 与改良组织贴块法相比，改良后的酶消化法培养原代VSMCs可在短时间内获得大量细胞，鉴定VSMCs纯度>98%，且细胞不易老化，传代存活率高。与传统体外钙化方法比，改良组的钙化更容易且稳定。结论 本研究通过改良的酶消化法提高了原代平滑肌细胞的存活率及培养效率，同时通过改良体外钙化诱导液配方，建立了良好的体外钙化模型。     

人子宫内膜腺癌细胞系的建立

目的构建人子宫内膜腺癌细胞系。方法将1例高分化子宫内膜腺癌手术切除的肿瘤组织制成单细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基进行原代培养,倒置显微镜下观察细胞形态,并用免疫荧光染色法检测其角蛋白。结果体外培养细胞传至50代以上,传代后细胞单层贴壁,散在生长,密度增加时见堆积现象,失去接触抑制,细胞质中角蛋白表达阳性。结论成功建立了人子宫内膜腺癌细胞系。