组织工程血管研究内容及性能评价

心血管疾病已成为人类社会的多发病,每年有许多患者需要接受血管移植手术.组织工程血管的出现和应用,特别是纳米材料的应用,将有希望解决血管来源问题.本文就组织工程血管的研究内容及其性能评价作一综述.     

骨髓来源细胞构建组织工程血管补片

目的探讨组织工程方法构建血管补片的可行性。方法用壳聚糖和透明质酸多孔多聚体支架构建高分子复合材料支架，将犬的骨髓细胞种植其中，并植入自身犬的肺动脉上，观察材料上细胞外基质生成及表面内皮化的情况，分别在术后2周、4周、8周用电镜、组化等方法来进行评价。结果所有动物在实验期问均存活，组织学及免疫组织化学显示，术后补片形成类似血管壁样组织。结论此复合材料和骨髓细胞可用来构建组织工程血管补片，其结构与血管壁类似。     

Bone marrow stem cells for urologic tissue engineering

OBJECTIVES: Experiments in rats and dogs have demonstrated the potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for urinary tract tissue engineering. However, the small graft size in rats and a failure to identify the MSCs in engineered tissues made it difficult to assess the true potential of these cells. Our goals were to characterize MSCs from pigs, determine their ability to differentiate into smooth muscle cells (SMCs) and use them in an autologous augmentation cystoplasty. METHODS: MSCs were isolated from pigs and analyzed for common markers of MSCs by flow cytometry. SMC differentiation was determined by immunoblotting. MSCs were isolated, genetically labeled, expanded in vitro, seeded onto small intestinal submucosa (SIS) and used for autologous bladder augmentation. RESULTS: Porcine MSCs are morphologically and immunophenotypically similar to human MSCs. Culturing MSCs at low density enhances proliferation rates. MSCs consistently differentiate into mature SMCs in vitro when maintained at confluence. Labeled MSCs grew on SIS over one week in vitro and survived a 2-week implantation as an autologous bladder augment in vivo. Some label-positive cells with SMC morphology were detected, but most SMCs were negative. Notably, many cells with a urothelial morphology stained positively. CONCLUSIONS: Porcine MSCs have similar properties to MSCs from other species and consistently undergo differentiation into mature SMC in vitro under specific culture conditions. Labeled MSCs within SIS may assist tissue regeneration in augmentation cystoplasty but may not significantly incorporate into smooth muscle bundles.     

干细胞在组织工程膀胱修复中的应用

利用干细胞进行膀胱缺损修复是近年来组织工程膀胱研究的一项热点.干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,是组织工程膀胱修复的理想种子细胞.本文分别就利用胚胎干细胞和成体干细胞作为种子细胞,进行膀胱缺损组织工程修复进行综述.     

骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管基质构建组织工程血管的初步研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管基质构建组织工程血管的可行性。方法：采用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸和曲拉通X-100对兔主动脉进行脱细胞处理，制备成脱细胞血管基质；体外分离和扩增人骨髓间充质千细胞，并将其作为种子细胞种植于脱细胞血管基质上，复合构建组织工程化人工血管。结果：制备的脱细胞血管基质由胶原、弹力纤维等组成，未见细胞成分残留；体外扩增的人骨髓间充质干细胞种植于脱细胞血管基质上可生长增殖。结论：骨髓间充质干细胞与脱细胞血管基质支架材料复合可成功构建组织工程血管，有望为血管缺损的修复提供一种全新的技术方法和手段。     

骨髓基质干细胞联合血管束植入构筑血管化组织工程骨

目的 研究兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)联合动静脉血管束植入异种脱蛋白松质骨(xenogeneic deproteinised cancellous bone,XDCB)构筑血管化组织工程骨,为构建组织工程化骨提供新的思路.方法 从兔髂嵴抽骨髓培养制备兔BMSCs,将第3代BMSCs种植于多孔XDCB并进行成骨诱导2周.手术中分离兔隐动、静脉血管束(vascular bundle,VB),以备穿过有孔的XDCB中.取24只新西兰大白兔,其中12只游离双侧兔隐动静脉血管束,共24侧;另外12只兔仅切开股骨外皮肤植入异种骨,共24侧.实验分4组(n=12),A组为单纯材料植入皮下组(XDCB组),B组为干细胞植入材料组(XDCB+ BMSCs组),C组为血管束植入材料组(XDCB+ VB组),D组为干细胞+血管束植入材料组(XDCB+ BMSCs+VB组),各组交叉配对.分别于术后2、4、8周行大体解剖、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、茜素红(ARS)染色、组织切片等检查,观察各组移植物血管化情况.结果 D组血管化组织工程骨组可见到血管新生、部分新生骨情况优于B组,也优于C组,而A组的异种骨中未测及相应血管化及成骨效能.结论 BMSCs联合动静脉血管束植入XDCB构筑的血管化组织工程骨有一定的成骨效能,并且可见到材料内部血管化,为构建组织工程化骨提供了新的思路.     

组织工程皮肤与创面再生性修复

Various skin defects resulting from mechanical injury,burns,chronic ulcers,and resection of tumor etc.are very common in clinic.The traditional treatment measure,such as grafting of autologous split-th...     

诱导骨髓基质细胞成血管平滑肌细胞的研究

目的 探讨体外诱导犬骨髓基质细胞(SMSC)为血管平滑肌细胞(VSMC)及其成血管的能力.方法 用含血小板源性生长因子(PDGF-BB)10ìg/L的内皮细胞培养液-2(EGM-2)诱导,无PDGF-BB的EGM-2培养液为对照,检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SM actin)与肌钙结合蛋白(calponin)的表达并接种于聚羟基乙酸(PGA)培养4周后取材.结果 诱导组(n=5)细胞逐步呈平滑肌样转变,表达a-SM actin与calponin,流式细胞仪阳性率分别为(45.16±0.97)%、(37.54 4±1.15)%,可成血管样结构,对照组(n=5)变化不明显,阳性率(7.92±1.04)%、(6.37±0.83)%,成血管样结构能力差.结论 体外可诱导犬BMSC为VSMC并有成血管样结构的能力.     

骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(rBMSCs)后复合到纳米羟基磷灰石(Nano-HA)体外构建仿生人工骨的可行性. 方法 采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,溶胶-絮凝法制备Nano-HA,用Ad-BMP-2转染体外培养的rBMSCs,免疫组化、RT-PCR和蛋白印迹方法检测转染后细胞的BMP-2表达.将转染48 h的细胞均匀接种到Nano-HA支架上,第3、5天取细胞载体复合物扫描电镜观察细胞贴附、生长状况,消化收集贴附支架的细胞,蛋白印迹检测贴附支架细胞BMP-2的表达.结果 转染后BMP-2基金在mRNA水平和蛋白水平均有高表达;扫描电镜见转染细胞在支架材料分布均匀,黏附良好,转染后及复合后Western Blot检测BMP-2表达较高.结论 利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外成功地构建了仿生人工骨.     

血管组织工程的进展

血管组织工程就是在体外构建理想的血管移植物。在过去20余年中涌现出了许多制备血管替代物的方法，包括胶原胶、脱细胞、细胞接种可降解材料等技术，这些成果显示了组织工程血管在临床应用方面的巨大潜力。目前，血管组织工程面临的挑战在于机械性能和抗血栓性，该领域今后的发展方向为细胞来源、体外培养环境、细胞增殖、黏附性和支架材料等。     

骨髓CD34+干细胞与单核细胞应用于组织工程小血管内皮化的比较

目的 探讨骨髓CD34+干细胞与骨髓单核细胞(MNCs)应用于组织工程小血管内皮化的效果,并作比较.方法 采集犬骨髓,经免疫磁珠分离出CD34+细胞,内皮细胞生长因子(VEGF)诱导分化为内皮细胞并扩增,行细胞免疫荧光、免疫组织化学和体外成血管实验鉴定;将培养后的细胞和未经分离的MNCs分别种植于人工小血管支架,扫描电镜观察,比较两组组织工程小血管的内皮化.结果 经流式细胞仪测定,分离后的细胞中CD34+细胞含量为(78.46±6.37)％.CD34+细胞培养2周后细胞基本铺满培养瓶底面,细胞呈“铺路石”状排列,CD31和Ⅷ因子免疫细胞化学染色均为阳性,体外成血管实验显示6h后CD34+细胞组出现较多毛细血管样网状结构.CD34+细胞组人工血管内膜化面积为(68.4±2.3)％,明显高于MNCs组人工血管内膜化面积(41.3±3.4)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 通过免疫磁珠方法可分离得到高纯度的骨髓CD34+细胞,经体外培养VEGF诱导后可定向分化为内皮细胞,种植于人工血管内表面,较MNCs组内皮化效果理想.     

骨髓源神经干细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的: 探讨骨髓源神经干细胞用于组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经缺损的治疗效果。方法: 36只Wistar大鼠随机分为3组, 每组12只。A组: 将骨髓源神经干细胞与ECM凝胶混合, 种植于几丁糖神经导管中修复10mm坐骨神经缺损; B组: 仅将ECM凝胶种植于神经导管中; C组: 坐骨神经切下10mm, 翻转180°后缝合。16周后, 行大体观察、神经电生理检测、腓肠肌湿重测定、组织学染色, 免疫组化染色和轴突计数等检查。结果: A组的各项检测指标与C组相近, 明显优于B组, 差异显著(P<0. 05)。结论: 骨髓源神经干细胞可作为周围神经组织工程的种子细胞修复周围神经缺损。     

Tissue engineering of heart valves in vivo using bone marrow-derived cells

In this study, we tissue-engineered heart valves in vivo using autologous bone marrow-derived cells (BMCs). Canine BMCs were differentiated into endothelial cell (EC)-like cells and myofibroblast (MF)-like cells. Decellularized porcine pulmonary valves were seeded with BMCs and implanted to abdominal aorta and pulmonary valve of bone marrow donor dogs. Histological examination of the explants identified the regeneration of valvular structures expressing CD31 and smooth muscle alpha-actin, indicating the presence of EC-like and MF-like cells in the grafts at 3 and 1 week, respectively, after implantation. Fluorescent microscopic examinations identified the presence of fluorescently labeled cells in the explants, indicating that the implanted BMCs survived and participated in the heart valve reconstitution. This study reports, for the first time, on tissue engineering of heart valve in vivo using BMCs.     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

负载不同浓度骨形态发生蛋白的组织工程骨体内成骨的量效关系

目的以聚乳酸-羟基乙酸[poly-(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA]为支架,负载不同浓度的骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP),与骨髓基质干细胞(bonemarrowstemcells,BMSCs)构建成新型的组织工程骨,并观察其体内成骨的量效关系。方法制作新西兰大白兔桡骨中段15mm骨缺损实验模型,植入不同含量BMP的组织工程骨。24只兔随机分为三组:第一组:植入同时负载5.0mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的组织工程骨(10只);第二组:植入同时负载2.5mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的组织工程骨(7只);第三组:植入同时负载1.0mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的组织工程骨(7只)。术后对动物进行大体观察,摄X线片观察各组术后4、8、12周骨缺损修复情况,比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度。于术后第4、8、12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察,图像分析骨缺损区域骨小梁的生成数量;取第12周标本行生物力学检测。结果X线片显示术后4周三组动物的桡骨缺损区域均有明显骨痂生成;12周时三组的骨缺损完全愈合率分别为7/8、3/5、3/5;各时相局部X线阻射密度值与新生骨小梁百分比计量显示第一组的新生骨痂及骨小梁最多,并可见髓腔再通现象。生物力学检测结果显示第一组的压缩刚度、扭转刚度、三点弯曲断裂载荷均大于其他两组。结论含5.0mgBMP的PLGA支架与BMSCs复合构建的组织工程骨修复兔桡骨15mm骨缺损的效果最佳。     

大鼠组织提取液对体外培养骨髓基质细胞的影响

目的研究大鼠脑组织成份和其它组织提取液对体外培养骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSC)的影响。方法提取大鼠全脑、灰质、白质、垂体、肌肉、肝脏等组织液,进行原代骨髓基质细胞培养,观察并测定其ALP染色阳性率。以空白培养液作对照,观察大鼠各组织提取液对骨髓基质细胞增殖,分化,矿化的作用。结果(1)各组织提取液对原代骨髓基质细胞培养后,其ALP染色阳性率以灰质和全脑组最高,其次是白质和肌肉组。(2)除肝脏组外其余各组织提取液对BMSC均有不同程度的增殖刺激作用,以灰质最强,其它依次为肌肉、白质、全脑与血清组,肝脏组则显示对BMSC增殖有抑制作用。(3)肝脏组对BMSC具有分化抑制作用,其它各组均显示分化刺激作用,增加程度依次为灰质、全脑、白质、肌肉与血清。(4)灰质组的矿化结节形成率最高,其它依次为全脑、白质、肌肉与血清。结论大鼠脑组织中的灰质提取液能显著刺激原代骨髓基质细胞增殖,且向成骨细胞诱导分化,并且在二代以后的BMSC培养中,表现出最强的刺激增殖、向成骨细胞分化和体外矿化的能力。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

自体骨髓基质干细胞复合珊瑚修复犬下颌骨节段缺损的初步研究

目的应用自体骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外扩增培养、成骨诱导犬BMSCs。将第二代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧3cm的下颌骨节段缺损(n=6);以单纯珊瑚植入缺损处为对照(n=6),术后12、32周分别通过影像学,大体形态观察,组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果成骨诱导的BMSCs在珊瑚支架上生长良好。X线片显示12周时实验组骨痂较多,对照组材料明显吸收;32周时CT、X线片和大体观察显示术后实验组骨愈合良好,对照组为骨不连;骨密度检测示实验组显著高于对照组(P<0.05);组织学示实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合;生物力学测试实验组与正常下颌骨力学强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论自体成骨诱导BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。