结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

结核分枝杆菌重组Bb-MPT64疫苗的构建、鉴定及表达

目的:构建和鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-MPT64疫苗.方法:以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到MPT64抗原编码基因序列,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入Bh及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-MPT64疫苗.用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达MPT64/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果:PCR成功扩增出688bp的MPT64目的基因;双酶切证实MPT64目的基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-MPT64疫苗构建成功.免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-MPT64的表达产物在相对分子量(50ku)处有明显的蛋白表达条带,且能被活动性结核病人血清特异识别.结论:成功构建了结核分枝杆菌rBb-MPT64疫苗,为发展新型结核病疫苗奠定了基础.     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-2基因双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B与白细胞介素2(IL-2)双顺反子真核表达质粒。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Ag85B基因。采用亚克隆的技术从pcDNA3.1-IL-2中获得小鼠IL-2基因的cDNA片段。将两者分别定向插入真核双表达载体pIRES,构建表达两个目基因的双顺反子重组质粒,然后用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及IL-2的表达。结果:酶切分析及序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及IL-2 mRNA。结论:成功构建了结核杆菌Ag85B及IL-2基因双顺反子真核表达质粒,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达

目的构建人结核杆菌热休克蛋白65（Hsp65）与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A,并检测其在体外的表达。方法利用聚合酶链反应（PCR）法及基因重组技术,以人结核杆菌基因组DNA为模板,扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A。将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达。结果经过测序证实重组质粒构建成功,该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA。结论成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A,该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达。     

融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性

目的: 构建融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白Ag85B-ESAT6真核表达载体,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力. 方法: 设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与pGEM-T-easy载体连接后测序. 将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆,分别命名为AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF,将重组质粒电转CHO细胞,RT-PCR检测融合蛋白mRNA的表达,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达;用重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度. 结果: PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致. RT-PCR可检测融合基因转录出mRNA,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光,AZ-pcDNA3-EF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1000,EZ-pcDNA3-AF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1500. 结论: Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功,有望为结核病的预防提供有效的基因疫苗.     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

Molecular cloning and expression of the immunodominant protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain]

OBJECTIVE: To provide the target gene and target antigen for the development of new vaccine against tuberculosis. METHODS: According to the gene sequence encoding protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, we designed a pair of oligonucleotide primers, obtained the gene by using polymerase chain reaction, and inserted the gene into the BamH I and EcoR I site of plasmid pBK-CMV to construct recombinant plasmid, and after that, the recombinant plasmid was transferred into E. coli XL1-Blue MRF' and induced with IPTG. The expression product of the gene was analyzed by using SDS-PAGE and western-blotting. RESULTS: The gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was successfully amplified by using PCR. A recombinant shuttle plasmid was constructed. The recombinant plasmid stably expressed recombinant Ag85A protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. CONCLUSION: A recombinant plasmid which contains the gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain has been successfully constructed. The recombinant plasmid can stably express recombinant protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. These results could serve as a basis for further studies on the usefulness of the gene and its expression product in the development of new vaccine against tuberculosis.     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。