应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体

目的 构建肾癌相关抗原G250重组腺病毒载体,以期用于基因转染树突状细胞(DC)治疗肾癌的实验研究.方法 利用AdMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC316-G250,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre以CaCL2法质粒共转染293细胞得到重组腺病毒Ad/G250,CsCl梯度离心纯化病毒,TCID50法测定病毒滴度.Ad/G250转染DC细胞,RT-PCR及流式细胞仪检测G250的表达.结果 采用双质粒共转染293细胞,Cre/loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含外源基因的Ad/G250载体.经过PCR、RT-PCR和流式细胞仪证实腺病毒载体构建成功.病毒经过CsCl梯度离心纯化后,Ad/G250滴度达到5.6×109 U/ml.RT-PCR及流式细胞仪显示Ad/G250在DC中特异性表达.结论 成功构建了G250重组腺病毒载体.     

负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的:构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复制缺陷型腺病毒.方法:将克隆有正义hTERTcDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315-hTERT与腺病毒包装质粒pBHGlox-DeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体(Ad-hTERT).对Ad-hTERT扩增、纯化并浓缩后,进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.结果:纯化浓缩后的Ad-hTERT滴度可达5×1012pfu/L.电镜下可见在HEK293细胞中形成的病毒颗粒,PCR双引物鉴定Ad-hTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段,而对照则不能扩出hTERT片段.结论:成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒.     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

携带人IL-10基因的腺病毒载体的构建及其对大鼠肝细胞损伤的保护作用

目的:构建携带人白细胞介素-10(hIL-10)基因的腺病毒载体,并验证其对大鼠肝细胞损伤的保护作用。方法:以pORF-hIL-10质粒为模板,PCR扩增hIL-10,插入腺病毒质粒pDC315,构建pDC315-hIL-10。将pDC315-hIL-10质粒与腺病毒包装质粒共转染293细胞,产生复制缺陷型重组腺病毒Ad5-hIL-10;感染大鼠肝细胞,免疫学方法鉴定目的基因的表达;建立CCL4诱导的大鼠肝细胞损伤模型,观察Ad5-hIL-10不同感染强度(MOI)预处理对损伤肝细胞存活率的影响。结果:经PCR扩增,证明已正确构建重组腺病毒Ad5-hIL-10。大鼠肝细胞感染Ad5-hIL-10后,随着病毒MOI的升高,hIL-10表达上升(F=52.667,P<0.001)。不同感染强度(MOI=1、5、10和50)Ad5-hIL-10预处理组大鼠肝细胞存活率较损伤对照组升高,差异有统计学意义(F=23.645、22.533、30.697、35.559,P均<0.001)。结论:成功构建了重组腺病毒Ad5-hIL-10,其能提高肝细胞的存活能力,对肝细胞有保护作用。     

携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定

目的：构建携带人白细胞介素10（hIL-10）和人肝细胞生长因子（hHGF）双基因的重组腺病毒载体。方法：分别以pDC316-hIL10-EGFP和pCDNA3-hHGF重组质粒为模板,PCR扩增获得hIL-10和hHGF基因片段,与pIRES连接成为hIL10-IRES—hHGF,测序正确后酶切,与pDC315连接,获得穿梭质粒pDC315-hIL10-IRES—hHGF,与腺病毒包装系统转染293细胞,包装产生重组腺病毒hIL10—hHGF,PCR鉴定后,扩增病毒,并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL-7402和WRL-68细胞,ELISA法检测上清液中hIL—10和hHGF的含量。结果：成功构建了重组腺病毒hIL10—hHGF,扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1&#215;10^9pfu／ml,转染BEL-7402和WRL-68细胞72h后,表达hIL-10的量分别为（6271．7&#177;5．2）pg/ml和（350．6&#177;12．4）pg／ml,表达hHGF的量分别为（20827．1&#177;345．5）pg／ml和（201．6&#177;10．1）pg／ml。结论：本实验为进一步研究Ad—hIL10—hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。     

腺病毒介导的脾酪氨酸激酶对血管平滑肌细胞表型转换的影响

目的 构建脾酪氨酸激酶(Syk)重组腺病毒并感染血管平滑肌细胞(VSMC),观察Syk对VSMC表型转换的影响.方法 运用pDC315-GFP腺病毒载体系统,细菌同源重组法构建含目的 基因Syk腺病毒重组质粒pDC315-GFP-Syk,经过包装、扩增、纯化后获得Syk重组腺病毒;测定病毒滴度并感染体外培养的大鼠VSMC,饥饿处理24 h,用Real-time PCR法和Western blot法对Syk、平滑肌22a蛋白(SM22α)及平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)表达活性进行检测,观察Syk对平滑肌细胞表型转换的影响.结果 成功构建携带Syk基因的重组腺病毒,纯化后滴度为1011 pfu/mL,腺病毒感染VSMC后5 d,与空病毒组和对照组相比,Syk mRNA(741638.70±35213.53)和蛋白表达水平(2.14±0.71)增高(P<0.01);α-SM-actin(0.80±0.04)和SM22α mRNA表达水平(1.00±0.01)下降(P<0.05),同时,二者的蛋白表达水平也降低(0.61±0.10和0.18±0.06,P<0.01).结论 在VSMC中,Syk通过对其表型转换进行调控,进而影响平滑肌细胞的增殖和迁移.     

构建携带hIL-10基因的腺病毒载体及其对大鼠肝细胞损伤的保护作用

目的:构建携带人白细胞介素(human interleukin,hIL)-10基因的腺病毒载体,细胞学及动物模型实验鉴定其介导的目的基因表达,并验证其对大鼠肝细胞损伤的保护作用?方法:以pORF-hIL10质粒为模板,PCR扩增hIL-10基因,插入腺病毒质粒pDC315,构建pDC315-hIL10?将质粒pDC315-hIL10与腺病毒包装质粒共转染至293细胞,产生复制缺陷型重组腺病毒Ad5-hIL10;感染大鼠肝细胞,免疫学方法鉴定目的基因的表达;建立体内外大鼠肝细胞损伤模型,验证Ad5-hIL10对肝细胞损伤的保护作用?结果:经PCR扩增?鉴定,证明已正确构建重组腺病毒Ad5-hIL10?大鼠肝细胞感染Ad5-hIL10后,随着病毒感染强度的升高,hIL-10表达明显上升?大鼠肝细胞体外培养模型预先感染病毒Ad5-hIL10,经四氯化碳诱导损伤,则细胞存活率随感染强度(multiplicity of infection,MOI)值升高而增加,至MOI=50时,细胞存活率恢复至92%;大鼠体内肝损伤模型显示,与损伤对照组和空白病毒对照组比较,Ad5-hIL10处理的大鼠肝细胞水样变性和间质炎症反应均减轻,肝功能的各项指标均有明显改善(P < 0.05)?结论:成功构建了重组腺病毒质粒Ad5-hIL10,且能明显提高肝细胞的存活能力,对肝功能有明显保护作用?     

含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装。结果ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致。两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应。结论成功克隆了分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCY—APM1为模板,聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1,并将其定向克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,经位点特异重组包装得到重组腺病毒Ad—APM1。通过Real—timePCR和Westernblot分别检测重组腺病毒Ad—APM1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒Ad-APM1包装成功,病毒滴度〉6．3×10^12pfu／mL。Real—timePCR和Westernblot检测证实APM1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。     

狨猴血清中重组人5型腺病毒中和抗体滴度的测定

目的构建表达荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP,检测血清中和抗体最佳实验方法, 分析小型灵长类动物普通棉耳狨猴体内腺病毒5型中和抗体水平,为评价腺病毒载体疫苗提供实验动物基础数据。方法利用 ADMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC315-Luc-GFP,将所得的穿梭质粒和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293A细胞, 进行重组人5型腺病毒（rAd5/Luc/GFP）的包装。通过3次空斑形成实验筛选出单克隆重组腺病毒,并在大量扩增单克隆腺病毒 后用CsCl密度梯度离心法进行浓缩纯化。采用TCID50法测定纯化后病毒滴度,并挑选进行中和实验的最优病毒滴度。将合 适病毒滴度的rAd5/Luc/GFP与狨猴血清混合预孵育后感染293A细胞,分别采用化学发光法及流式细胞术,对14只普通棉耳狨 猴血清中腺病毒5型中和抗体进行检测。结果PCR、酶切和测序结果均表明穿梭质粒pDC315-Luc-GFP构建成功;GFP检测 结果证明重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP包装扩增成功,病毒滴度可达6.9×1011.5 PFU/mL。两种不同方法检测检测14只狨猴 的中和抗体结果一致性较好（P<0.05,Kappa=0.811）,化学发光法或流式细胞术检测阳性狨猴比率分别为28.6%（4/14）或21.4% （3/14）,化学发光法检测得其中2只狨猴中和抗体滴度为1/16,另2只为1/32,而流式细胞术检测得滴度均为1/16。结论化学发 光法是一种快速,准确,适用于多物种的方法,其灵敏度略高于以GFP为报告基因的流式细胞术（7.2%）。普通棉耳狨猴体内 Ad5血清阳性率较低,有望应用基于此型或其他型别腺病毒作为载体进行基因治疗和基因疫苗研究。     

携带hVEGF121-EGFP融合基因的腺病毒表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子121(HUMAN VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR121,HVEGF121)和增强型绿色荧光蛋白(ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN,EGFP)融合基因的腺病毒表达载体,观测其表达。方法以PUC18-HVEGF121质粒中的HVEGF121CDNA为模板,用PCR法扩增HVEGF121CDNA片段并去除其终止密码子,将此片段连接到含有EGFP CDNA的PEGFP-N1质粒中,再将融合基因HVEGF121-EGFP克隆到穿梭质粒PDC315中,与腺病毒质粒共同转染293细胞,构建重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度,并用免疫组化法检测VEGF121在NIH3T3中的表达。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为1.2×1010~2.7×1011PFU/ML。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光表达。免疫组化结果也证明VEGF121能在NIH3T3中的表达。结论构建的HVEGF121-EGFP腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗,并观察外源基因在体内的表达。     

Construction and identification of recombinant adenovirus-mediated gene transfer system for rat vascular endothelial growth factor

Objective To construct the recombinant adenovirus vector carrying rat vascular endothelial growth factor(VEGF), as preparation for genetic transfection that follows. Methods Rat VEGF was obtained by using RT-PCR amplification and then cloned into the shutter plasmid pDC316. Subsequently, this newly constructed plasmid pDC316-VEGF, after identification by nuclease digestion analysis and sequencing analysis, was transfected into human embryonic kidney cells HEK293 by Lipofectamine 2000 mediation, together with adenovirus-packaging plasmid pBHGE3. Based on the homologous recombination of the two plasmids within HEK293 cells, the recombinant adenovirus vector carrying VEGF and VDC316-VEGF was created. VDC316-VEGF was subsequently identified using PCR, purified using repeated plaque passages, proliferated using freezing and melting within HEK293 cells, and titrated using 50% Tissue Culture Infective Dose(TCID50) assay. ResultsThe newly constructed recombinant adenovirus was confirmed to carry rat VEGF based on PCR results, and its titration value determined based on TCID50 assay was 3×109 pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus carrying rat VEGF was successfully constructed. The newly constructed adenovirus can produce a sufficiently high titration value within HEK293 cells, providing a reliable tool for genetic transfection in further gene therapy researches.     

表达抗G250人源性抗体腺病毒对肾癌细胞的影响

目的检测腺病毒Ad-G250表达的G250全长人源性抗体的生物学活性及其对肾癌细胞的影响。方法扩增纯化腺病毒Ad—G250、Ad—EGFP（对照病毒）。病毒感染LO-2细胞,ELISA法检测细胞培养液中抗体的表达量。收集病毒感染后的细胞上清液进行纯化,Westernblotting检测纯化抗体的相对分子质量及其与细胞表面G250抗原的结合能力。免疫组化法检测Ad—G250表达的抗体是否具有生物学活性。CCK-8法检测Ad—G250对肾癌Ketr-3及ACHN细胞增殖的影响。AnnexinV—PE／7-AAD法检测Ad—G250对‘肾癌Ketr-3及ACHN细胞凋亡的影响。结果病毒Ad—G250感染LO-2细胞后G250抗体的表达量随着感染天数的增加而增加。Westernblotting实验显示Ad—G250能够表达G250抗体的轻链和重链,电泳图上该抗体能使G250抗原阳性的Ketr-3和786-O细胞在相对分子质量58×10’附近出现反应条带,而G250抗原阴性的ACHN和HK-2细胞在相应位置无反应条带。细胞免疫组化实验显示Ketr-3细胞膜被染成棕黄色,而ACHN细胞未见着色。CCK-8实验结果显示,Ad—G250对Ketr-3细胞有抑制作用,而对ACHN细胞的抑制作用不明显;Ad—G250抑制Ketr-3细胞增殖存在浓度及时问依赖性。凋亡实验显示,Ad—G250诱导Ketr-3细胞凋亡作用和ACHN细胞相比差异具有统计学意义,Ad—G250诱导Kert-3凋亡作用和Ad—EGFP相比差异有统计学意义。结论腺病毒Ad—G250成功表达出具有生物学活性的人源性G250抗体,且Ad—G250可抑制表达G250抗原的肾癌细胞增殖,诱导其凋亡。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.