大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白的表达：失神经状态下Western blot方法测定

背景: 近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素，是组成骨构架的基质蛋白；而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。 目的：观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-05/12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。 材料：选用3月龄健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为2组，单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。 方法：单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根φ0.8 mm克氏针，制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上，横断切除T10 段脊髓约0.3 cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。 主要观察指标：分别于伤后1，2，4，5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ，Ⅱ型胶原的蛋白表达。 结果：伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ，Ⅱ型胶原均有表达，脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组(P < 0.05)；伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值，高于单纯胫骨骨折组(P < 0.05)；伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值，高于脊髓损伤并胫骨骨折组(P < 0.05)，脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达；伤后第5周两组Ⅰ，Ⅱ型胶原表达量均下降。 结论：失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致，区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。     

失神经状态下胫骨骨折断端骨痂成骨的组织学变化

摘要 背景：有研究表明神经系统在骨折的修复重建中发挥重要的作用，但其具体机制尚未阐明，中枢神经及神经生长因子对骨痂中成骨的影响至今少有报道。 目的：观察失神经状态下胫骨骨折断端骨痂成骨的组织学变化。 方法：用SD大鼠建立左胫骨闭合骨折髓内固定大鼠模型，建模成功后随机为3组，左胫骨骨折组；T10脊髓横断组：于左胫骨骨折后，横断切除T10段脊髓约0.3 cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型；神经生长因子治疗组：建立T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型后，肌注神经生长因子。术后各组均用苏木精伊红染色法观察骨组织形态变化，骨钙素免疫组织化学法观察骨痂中成骨情况，透射电镜观察成骨细胞内微结构变化。 结果与结论：T10脊髓横断组大鼠在失神经状态下，骨痂中成骨细胞的数量减少，骨钙素表达减少，成骨细胞内细胞器功能低下。神经生长因子治疗组的以上各组织学观察指标均较T10脊髓横断组均有不同程度的改善。结果显示，神经生长因子可部分改善脊髓横断失神经状态下的骨组织再生情况。     

重组人骨形态发生蛋白2晚期自体骨痂成骨对血管内皮生长因子表达的影响

背景：重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白7治疗骨缺损已经应用于多种实验动物模型。作者前期实验在兔自体髂骨与骨痂骨等长骨骨折治疗中应用，已取得满意效果。 目的：验证采用骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2移植治疗骨缺损效果，并观察血管内皮生长因子对骨折愈合的影响。 设计、时间及地点：随机对照实验，于2008-08/2009-01在本溪市中心医院科研实验室和中国医科大学附属二院实验动物中心完成。 材料：2.0~2.5 kg的成年健康日本大耳白兔20只。 方法：将兔行双侧桡骨中段模拟骨折，12周后观察至明显骨痂生长随机分配实验Ⅰ组10只，实验Ⅱ组10只。在原骨折部位手术，切除骨痂备用，同时切除骨折端使之缺损1.5 cm，实验Ⅰ组，左桡骨移植复合重组人骨形态发生蛋白2骨痂为为骨形态发生蛋白2骨痂组，右桡骨移植髂骨为移植自体髂骨组，实验Ⅱ组，左桡骨移植晚期自体骨痂为移植晚期自体骨痂组，右桡骨空白对照为空白对照组。 主要观察指标：于术后14 d取标本检测各组兔血管内皮生长因子基因mRNA表达水平的。 结果：骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)；移植晚期自体骨痂组、空白对照组血管内皮生长因子未见明显表达。骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子蛋白表达及基因表达明显高于移植晚期自体骨痂组、空白对照组(P < 0.05)。 结论：骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2明显促进血管内皮生长因子的合成分泌，对促进骨缺损愈合有积极意义。     

聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因修复老年大鼠的股骨骨折☆

目的：为避免病毒载体带来的安全隐患，利用新型的非病毒载体聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因，观察其对老年大鼠骨折愈合过程的影响，以寻找能够有效促进老年骨折愈合的基因治疗方法。 方法：实验于2006-04/2007-04在解放军第二军医大学细胞生物学实验室和实验动物中心完成。①实验分组：取雄性SD大鼠24只，其中20月龄18只随机分为基因治疗组、生理盐水组和空白对照1组3组，4月龄6只为空白对照2组。②实验方法：所有大鼠建立股骨骨折模型，1周后基因治疗组骨折断端经皮注射聚乙烯亚胺和骨形态发生蛋白7基因转染试剂 250 μL，生理盐水组断端经皮注射相同体积生理盐水，其他2组不加处理。③观察指标：骨折第8周摄X射线片，然后取标本行组织病理切片、Ⅰ型胶原免疫组化染色，观察各组骨折愈合情况。 结果：24只大鼠均进入结果分析。骨折第8周4月龄大鼠骨折基本愈合，3组老年大鼠骨折均未完全愈合，但X射线片、苏木精-伊红染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色结果显示，与生理盐水组和空白对照1组相比，基因治疗组骨痂明显增多、骨痂骨化过程提前，Ⅰ型胶原染色深、面积较大，说明愈合速度加快、愈合能力改善。 结论：20月龄老年大鼠骨折愈合过程明显延缓，聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白7基因体内转染的方法可以增强老年大鼠骨折修复能力、促进老年大鼠骨折愈合。     

骨形态发生蛋白2在骨质疏松症大鼠骨折愈合过程中的表达**☆

目的：骨折愈合过程中，间充质细胞向骨折部位迁徙并分化为软骨细胞及成骨细胞是其中的关键性环节，骨形态发生蛋白2在其中具有重要作用。观察骨形态发生蛋白2在绝经后骨质疏松症大鼠胫骨骨折早期愈合过程中表达的变化，探讨骨质疏松症骨折延迟愈合的原因。 方法：实验于2005-08/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。①实验材料及分组：64只6个月龄雌性SD大鼠随机分为去势组和对照组，每组32只。②实验过程：去势组行双侧卵巢切除建立Ⅰ型骨质疏松动物模型，对照组切除少量脂肪组织。3个月后造成胫骨骨折。③实验评估：两组于术后7，14，21，28 d麻醉状态下各取大鼠8只，取胫骨周围少量软组织和外骨痂的骨折断端、骨痂、骨皮质及骨髓腔的全层标本，分别进行组织学、免疫组织化学，半定量反转录-聚合酶链反应方法检测。 结果：①组织学观察结果：显示骨折处膜内成骨和软骨成骨两种方式，术后第21天及28天时去势组骨痂中仍可见大量软骨细胞。②免疫组织化学结果：术后第7天及14天对照组骨形态发生蛋白2平均吸光度值大(阳性细胞计数高)于去势组，而在术后第21天低于去势组。③反转录－聚合酶链反应结果：术后第7天对照组骨形态发生蛋白2条带强度高于去势组，而在第14天弱于去势组。 结论：骨形态发生蛋白2在骨折早期骨痂形成中具有重要作用，骨质疏松症骨折愈合早期骨形态发生蛋白2的表达量减少且延迟，可能是其愈合延迟的重要影响因素。     

合并中枢神经损伤骨折愈合过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的作用

背景：胰岛素样生长因子Ⅰ由成骨细胞合成,并对成骨细胞具有促进增殖和分化作用。 目的：观察中枢神经损伤对胰岛素样生长因子Ⅰ在血清、局部骨痂的表达及骨折愈合的影响。 方法：取Wistar大鼠随机分成正常对照组、脑损伤-骨折组、脊髓损伤-骨折组、单纯骨折组。于术后第1,2,3周测量血清中胰岛素样生长因子Ⅰ水平;术后第2,3周行X射线摄片评估骨痂愈合情况,术后1,2,3,4周取股骨制作标本,测量骨痂体积,术后3 d,1,2周免疫组织化学染色法检测骨痂局部胰岛素样生长因子Ⅰ的表达。 结果与结论：正常对照组、单纯骨折组的胰岛素样生长因子Ⅰ血清质量浓度无明显变化,脑损伤-骨折组和脊髓损伤-骨折组骨痂体积、X射线评分高于单纯骨折组(P < 0.05);伤后3 d, 1,2周时,脑损伤-骨折组和脊髓损伤-骨折组胰岛素样生长因子Ⅰ的血清质量浓度较其他两组明显增加(P < 0.01);伤后1周,脑损伤-骨折组和脊髓损伤-骨折组骨折端平均阳性细胞数高于单纯骨折组(P < 0.01)。提示中枢神经损伤可以影响血清中胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度和骨痂局部的表达,从而能促进骨折愈合。     

脑损伤并胫骨骨折大鼠骨痂中神经肽的分布及意义*☆

目的: 研究证明，含有P物质、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽、神经肽Y和酪氨酸羟化酶等神经肽的肽能神经共同存在于骨组织中，主要分布于骨代谢活跃的区域，表明这些肽能神经与骨的生长、发育密切相关。观察脑损伤后大鼠胫骨骨痂中神经肽的表达。 方法：实验于2007-02/05在广西医科大学实验动物中心完成。①实验分组：雄性Wistar大鼠130只，体质量450~550 g，随机数字表法分为单纯骨折组（n =60），脑损伤合并骨折组（n =60），正常对照组（n =10）。②实验方法：麻醉后显露大鼠右颅顶骨，中线旁2 mm 处开直径5 mm 骨窗，液压打击致中度脑损伤，并制备大鼠胫骨骨折模型，其中单纯骨折组头部只做颅骨开窗，正常对照组不做任何处理。③实验评估：术后3，7，14，21，28，35 d 苏木精-伊红染色和神经肽免疫组织化学染色观察神经肽在大鼠胫骨中的分布及胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。计算机X射线摄像仪（CR）摄片测定术后14，21，28 d 脑损伤合并骨折组及单纯骨折组骨痂面积大小。 结果：纳入大鼠130只，均进入结果分析。①脑损伤合并骨折组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂，骨痂中神经肽免疫阳性神经纤维较多，明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞质内降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠肽、酪氨酸羟化酶、神经肽Y强阳性表达。②脑损伤合并骨折组14 d 纤维骨痂中的软骨细胞团增大，骨膜下软骨细胞层增厚；21 d 小梁骨明显增厚，软骨岛增大；28 d 仍可见大量的纤维骨痂和软骨骨痂，软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成。单纯骨折组骨膜反应轻，纤维骨痂量少，骨内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主，骨折愈合过程明显晚于脑损伤合并骨折组。③14，21 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积较单纯骨折组大（P < 0.01）；21，28 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积变化明显快于单纯骨折组，提示骨痂塑性快（P < 0.01）。CR摄片发现，各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象，单纯骨折组骨折线清晰，骨痂量较少；脑损伤合并骨折组骨性愈合较好，骨痂量较多，骨折线模糊。 结论：正常大鼠骨生长活跃区有丰富的肽能神经支配。脑损伤后骨痂中神经肽有显著改变，并引起骨痂量和质的改变，骨折愈合加速。     

合并脑损伤时骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子的表达

背景：大量临床病例显示,骨折合并脑损伤患者骨痂量明显增多,骨折愈合速度明显加快。但对合并脑损伤时骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子的表达及作用机制缺乏前瞻性对照研究,对其潜在的机制尚未阐明。 目的：对比观察SD大鼠在骨折合并脑损伤以及单纯骨折时骨折愈合过程中骨痂内血管内皮细胞生长因子的表达变化。 方法：将SD大鼠以数字表法随机分为3组：正常对照组、单纯骨折组、骨折合并脑损伤组。脑损伤模型采用改进的Marmarou自由落体装置撞击大鼠颅骨制作弥漫性中度脑损伤模型;于左侧胫骨髁间处钻孔,插入无菌克氏钢针,在胫骨中上1/3处横向折断胫骨,制作骨折模型。术后X射线摄片观察骨折修复过程和效果;RT-PCR检及免疫组化染色观察骨痂标本血管内皮细胞生长因子表达。 结果与结论：骨折后3,7,14 d,单纯骨折组、骨折合并脑损伤组X射线表现无明显差别。与单纯骨折组相比,骨折后 24 d脑损伤合并骨折组骨折线变得模糊,形成较多骨痂量;42 d后骨折线消失,伤肢基本愈合。单纯骨折组骨痂中血管内皮细胞生长因子骨折后7 d开始出现,表达逐渐增强,约3周时达高峰,42 d已经不见血管内皮细胞生长因子表达;脑损伤合并骨折后3 d即可见血管内皮细胞生长因子表达,两三周达高峰期,其表达高峰提前且持续时间较长。说明脑损伤后大鼠骨折愈合加速,骨痂量增多,表明脑损伤对骨折愈合有促进作用,这可能与脑损伤后大鼠体内生长因子血管内皮细胞生长因子表达高峰提前且持续时间较长有关。     

糖尿病骨折大鼠骨痂组织中成骨细胞增殖和骨钙素表达与骨形态发生蛋白2干预的关系☆

背景：有研究表明，糖尿病患者骨折愈合过程中局部骨形态发生蛋白2明显降低，成骨细胞增殖能力下降，骨折延迟愈合，或者不愈合。 目的：观察骨形态发生蛋白2治疗糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨痂组织成骨细胞增殖和骨钙素的表达，分析骨形成蛋白在糖尿病大鼠骨折愈合过程中的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-09/12在昆明医学院动物实验中心完成。 材料：SD雄性大鼠30只，20只腹腔内注射链脲佐菌素破坏胰岛细胞诱导为糖尿病大鼠后，随机均分为骨形态发生蛋白2组、模型对照组，另10只为正常对照大鼠，腹腔内注射等容量生理盐水。 方法：3组大鼠行右胫骨上段骨折建立大鼠胫骨骨折模型。骨形态发生蛋白2组用10 μg/kg骨形态发生蛋白2治疗，模型对照组及正常对照组给予等渗量生理盐水。 主要观察指标：伤后第1，2，4，6周X射线片观察骨折愈合情况，光镜下观察骨痂内成骨细胞数量，放射免疫法测定血清骨钙素表达。 结果：骨形态发生蛋白2、正常对照组X射线片显示骨痂生成量多，骨折愈合程度明显优于模型对照组(P < 0.01)。骨形态发生蛋白2组成骨细胞数量明显多于模型对照组，略低于正常对照组。各组血清骨钙素均呈上升趋势，在第2周达到峰值，第4周下降，至第6周进一步下降。模型对照组骨钙素升高幅度明显低于正常对照组(P < 0.01)，并且低于骨形态发生蛋白2组。骨形态发生蛋白2组、正常对照组的骨钙素差异无显著性意义。 结论：糖尿病大鼠骨折愈合过程中较正常大鼠，骨钙素水平降低，成骨细胞增殖下降，采用骨形态发生蛋白2治疗可提高骨钙素水平，促进成骨细胞增殖，促进骨折愈合。     

小夹板外固定与钢板内固定材料置入对骨折断端成骨活性的影响

背景： AO技术存在许多的缺陷，如“应力遮挡”产生的负面效应等。近年来国内外学者认为弹性固定法最合理，是最有利于骨折愈合的治疗理念。 目的：观察小夹板外固定对兔长管状骨骨折断端成骨活性的影响，并与钢板内固定材料置入方法比较。 设计：随机对照动物实验。 单位：湖北中医学院骨伤科研究所。 材料：实验于2006-04/2007-04在湖北中医学院骨伤实验室完成。30只家兔随机分成小夹板固定组、钢板固定组，每组15只。自制小夹板，由具有较好弹性的杉树皮制成。分前后、内外侧四块夹板，夹板上宽下窄，在前后侧夹板靠近胫骨结节部刺一小孔。钢板由江苏金鹿集团医疗有限公司提供。 方法：在左胫骨中下1/3处造成3 mm骨缺损横行骨折模型，小夹板固定组用石膏固定5 d后换成小夹板外固定，钢板固定组用4孔钢板内固定。术后14，24，34 d时分批处死各组动物，通过肉眼观察骨折处骨痂生长情况，并观察骨折愈合过程中骨痂组织形态学及骨生成细胞情况。 主要观察指标：不同时期兔胫骨骨痂肉眼观察，骨痂组织形态学和骨生成细胞情况。 结果：小夹板固定组骨痂形成早，早期成骨细胞丰富且活跃，34 d时骨折全部骨性连接。钢板固定组：14 d时骨折端见少量的纤维骨痂，仍有肉芽组织，24 d时见少量的软骨连接，34 d时骨痂已跨过骨折端，但未完全连接。小夹板外固定组与钢板固定组比较，骨折各期形成的骨痂量多，骨折愈合快 结论：小夹板外固定能促进骨折处成骨细胞的分化增殖和血肿的吸收、骨痂的钙化、骨小梁的生长改建。