腺病毒与慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性对比研究

目的观察比较腺病毒载体(adenovirus vector,AV)与慢病毒载体(lentivirus vector,LV)分别介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent proteins,EGFP)对体外培养的兔角膜基质细胞(rabbit corneal stroma cells,RCSC)的转染效率,探讨较优一种病毒载体作为角膜基因治疗载体的可行性。方法行离体RCSC原代、传代培养及鉴定;实验分为转染组(AV-EGFP转染组和LV-EGFP转染组)和对照组,观察转染组在不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)及感染后24h、48h、72h在倒置荧光显微镜下EGFP的表达情况,流式细胞技术检测转染效率。结果 AV-EGFP转染组感染RCSC后从24～48h就开始可见明显的绿色荧光,起始时间早于LV-EGFP转染组(48h)。LV-EGFP转染组在MOI≤1000时,随着MOI值增大,检测到的细胞转染率逐渐增大,两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);AV-EGFP转染组在MOI>10时,随着MOI值增大,检测到的细胞转染率逐渐增大,两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);而在同一MOI值下(MOI>1),LV-EGFP较AV-EGFP转染效率更高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 AV与LV均可有效转染离体RCSCs同一MOI值下(MOI>1),LV转染效率更高。     

慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究

背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性,已有学者用其进行眼表重建,其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。方法利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs,荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达,倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态,用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率,然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞一角膜基质移植材料。手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型,随机分为2组,实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料,对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料,每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况。1个月后处死动物摘除眼球,荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达,用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8（CK8）、CKl8和CKl2的表达,以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞。结果大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似,流式细胞仪检测显示瞬时转染48h的人AECs中EGFP阳性表达率最高,为61．50％,与12、24、96h转染组15．24％、38．27％、39．10％比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,与72h转染组的58．36％比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明,组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光,免疫组织化学结果显示CK8、CKl8、CKl2表达均为细胞质棕色染色,细胞核蓝染。对照组兔眼角膜均混浊、水肿,荧光显微镜下未见荧光,且部分角膜组织有CK8、CKl8表达,无CKl2表达。结论EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层,可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源。慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具。     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质

目的 应用基因转染技术将绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质绌胞，以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪。方法 构建携带EGFP基因的重组逆转录病毒载体PLNCX2-EGFP，转染兔角膜基质细胞，然后将该细胞接种于PGA，形成细胞-生物材料复合物，移植于母兔角膜基质板层内。术后8周，组织学切片，HE染色，荧光显微镜下对绿色荧光蛋白(GFP)进行示踪观察。结果 8周后，组织工程化角膜组织形成，组织学切片显示PGA完全降解，新生组织形成，组织排列规整，荧光显微镜下见新生组织呈绿色，提示EGFP表达。结论 组织工程角膜基质的组织学结构与角膜基质相类似。新生组织表达GFP，证实组织工程角膜基质组织的构成源于供体细胞。     

骨髓基质细胞玻璃体内移植的实验研究

目的 :观察兔自体骨髓基质细胞 (marrowstromalcells,BMSCs)在玻璃体腔内的存活情况。方法 :采用贴壁筛选法将兔骨髓进行体外培养以获得大量扩增的骨髓基质细胞 ,移植前将骨髓基质细胞用DAPI标记后注射入自体玻璃体腔内。移植 4w后处死动物 ,取眼球做连续冷冻切片 ,进行HE染色和荧光显微镜检查。结果 :玻璃体腔内可见到DAP1阳性细胞。连续切片HE染色显示玻璃体腔内细胞聚集成团 ,细胞形状不规则 ,伸出突起 ,胞核大而圆 ,类似视网膜外颗粒层样细胞。结论 :移植BMSCs在玻璃体腔内至少能存活 4w ,在眼内微环境中有向视网膜样细胞分化的趋势。玻璃体内移植是一种简便、可行的移植方法     

组织工程技术构建兔角膜基质组织的实验研究

目的 探讨应用组织工程技术构建兔角膜基质层组织的可行性。方法 新西兰大白免40只,即母兔及其亲生子兔共20对。分离获取新生子兔角膜基质细胞,扩增、培养,汇合后,接种于聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,移植于对应的母兔角膜基质层。绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质细胞,示踪角膜基质构建过程。同时,对侧角膜仅行PGA移植,作为材料对照组。8周后取材,行组织学切片,Western blot检测Ⅰ型胶原及电镜下测定胶原纤维直径分布。结果术后8周,实验侧角膜逐渐恢复透明,形成新生角膜基质样组织,胶原与角膜表面平行,排列较整齐,组织学结构接近正常基质组织。实验组Western blot检测提示新生组织中基质细胞表达Ⅰ型胶原;电镜下胶原纤维直径[(29.0±4.7)nm]与正常角膜基质组织比较[(28.5±3.5)nm],差异无显著意义(P>0.05)。对照组正常角膜无新生基质组织形成。GFP标记角膜基质细胞,示踪角膜基质第8周时,荧光显微镜下可见新生组织呈绿色,提示GFP表达。结论 应用组织工程技术可以在兔受体角膜内构建角膜基质层组织。(中华眼科杂志,2004,40:517-521)     

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。     

体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

羊膜载体培养标记兔角膜内皮细胞移植的研究

目的探讨以羊膜基底膜为载体培养兔角膜内皮细胞移植的可能性,为培养内皮细胞移植治疗角膜内皮失代偿疾病提供依据与方法。方法体外培养扩增兔角膜内皮细胞,采用亲脂性碳青染料(CM-DiI)对细胞进行标记,种植于去除上皮细胞的羊膜基底膜上,体外培养形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学、超微结构及细胞标记情况的观察;将羊膜为载体培养的内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植和单纯角膜后板层切除为对照,术后观察角膜透明度与厚度,对其进行组织学与细胞标记情况的检测。结果 5～7d 角膜内皮细胞即在羊膜基底膜上融合成单层,细胞为扁平多角形,排列紧密,密度可达(3202.84±347.77)个/mm~2,荧光显微镜下可见内皮细胞被 CM-DiI 标记后显现红色荧光;培养内皮层移植后角膜维持相对的透明与薄度,而无内皮细胞羊膜移植和单纯后板层切除两组对照角膜严重水肿、混浊,厚度明显超过实验组角膜;培养内皮移植后角膜形成新的内皮层,通过标记的细胞发现移植后细胞仍为培养移植的内皮细胞而非周边细胞的移行。结论羊膜基底膜是角膜内皮细胞生长和移植的良好载体,体外培养角膜内皮细胞移植有望代替供体角膜移植,具有广阔的应用前景。(中华眼科杂志,2006,42:925-929)     

前段光学相干断层扫描在穿透性角膜移植术后移植上皮变化中的应用

目的:使用前段光学相干断层扫描(AS-OCT)评估在穿透性角膜移植术(PK)后角膜上皮厚度的变化,并确定上皮厚度在移植排斥反应早期检测中的作用。方法:前瞻性比较观察研究。共纳入20例20眼接受穿透性角膜移植术患者做为研究组,对照组16例16眼。术后2wk、1mo和3mo使用AS-OCT测量角膜厚度。术后3mo,与对照组排斥反应和上皮厚度及分布参数进行比较。结果:术后1mo,研究组的上、下、最大和最小上皮厚度值均显著低于术后2wk(P=0.0004,0.0001,0.0001,0.04),术后3mo与1mo相比无显著差异(P=0.4,0.1,0.8)。与术后2wk相比,1mo时上皮厚度的降低明显高于基质厚度(P=0.04)。角膜上皮厚度变化显示,研究组和对照组的角膜上皮厚度分布模式相似,出现明显的角膜水肿。但是,对照组中央角膜厚度(CCT)明显更高。结论:角膜移植术后移植物上皮重塑的定量评估显示,早期变化有助于角膜移植物厚度的显著改善。角膜上皮厚度和分布模式的变化可作为角膜移植排斥反应的指标。     

圆锥角膜行去上皮角膜胶原交联术后角膜微结构的变化

目的：采用共焦显微镜观察进展期圆锥角膜行去上皮角膜胶原交联术后角膜微结构的变化。

方法：选取2016-02/2017-02于我院行上皮角膜胶原交联术治疗的进展期圆锥角膜患者11例15眼,分别于手术前后行共焦显微镜检查,观察角膜微结构变化。

结果：术后早期角膜上皮下神经纤维显著减少或消失; 角膜前基质呈蜂窝状,几乎无典型的角膜基质细胞,术后3mo基质细胞开始出现,术后12mo基质细胞数量几乎恢复到术前水平,但角膜上皮下神经仍稀疏,未达到术前水平; 术后后部角膜基质细胞和内皮细胞大小及形态未受影响。

结论：角膜胶原交联术后角膜微结构发生变化最明显的是上皮下神经纤维和前基质细胞,但随着随诊时间的延长,这种变化呈逐渐减弱趋势。     

近视合并高度散光行FS-LASIK术后早期前后表面曲率及散光和前房深度的变化

目的:对FS-LASIK术矫正近视合并高度散光早期前房深度、前后表面曲率及散光的变化进行观察并与较低散光组对比。方法:选取2016-01/2019-05在我院行飞秒制瓣LASIK手术治疗复合性近视散光且3mo内有完整随访记录的患者进行回顾性分析,根据手术设计的散光大小分为两组:A组71例106眼,散光-2.00-5.00D,等效球镜-6.15±1.74D;B组63例106眼,散光-0.25^-1.00D,等效球镜-6.67±1.04D;常规围手术期检查。所有病例按照飞秒制瓣LASIK术式常规操作流程完成手术。比较两组术后前房深度、前后表面曲率及散光。结果:术前和术后1wk,1、3mo两组后表面曲率、散光及前房深度变化无差异(P>0.05)。术后1wk,1、3mo两组前表面曲率无差异(P>0.05)。A组前表面散光术后1wk与1、3mo均有差异(P<0.05),1mo与3mo无差异(P>0.05)。B组前表面散光术后1wk^3mo无差异(P>0.05)。结论:近视合并高度散光行FS-LAISK术后后表面曲率、散光及前房深度无明显变化,前表面曲率在术后1wk^3mo较稳定,但前表面散光数值在术后1wk^3mo时略呈现增加趋势,在术后1~3mo较稳定。     

LASIK术后不同时间应用噻吗洛尔对高度近视屈光回退的影响

目的：观察LASIK术后不同时间应用噻吗洛尔对高度近视患者屈光回退的影响。

方法：前瞻性研究。选取2015-08/2016-08收入我院的高度近视患者90例180眼为研究对象,随机分为对照组和观察组,各45例90眼,两组患者术后均常规使用抗生素滴眼液7d,对照组患者于术后第8d开始使用噻吗洛尔滴眼液,观察组患者于术后第1d开始使用噻吗洛尔滴眼液。分别于术前、术后7d,1、3、6mo检测并比较两组患者裸眼视力、等效球镜度、眼压、角膜表面曲率、角膜基质厚度。

结果：术后不同时间点两组患者裸眼视力、等效球镜度均有差异(P<0.05),且术后6mo,观察组患者裸眼视力、等效球镜度均优于对照组(0.03±0.01 vs 0.08±0.01; 0.15±0.33D vs -0.17±0.36D; 均P<0.05)。术后不同时间点两组患者角膜基质厚度和角膜表面曲均无组间差异性(P>0.05)。术后7d,1、3mo观察组患者眼压均明显低于对照组(均P<0.05),术后6mo两组患者眼压趋于稳定。

结论：LASIK术后早期应用噻吗洛尔能有效降低眼压,并保持相对较长时间眼压稳定,阻止角膜膨隆,进而起到预防屈光回退的效果。     

不同撕囊直径下行囊袋内超声乳化对角膜和血-房水屏障的影响

目的：初步探讨不同撕囊直径下行囊袋内超声乳化对角膜和血-房水屏障的影响。

方法：选取2016-05-01/2017-04-31在潍坊眼科医院行飞秒激光辅助超声乳化手术的白内障患者(78例100眼)。术前按照撕囊直径分为试验组36例50眼,术中撕囊直径4.7mm; 对照组42例50眼,术中撕囊直径6.0mm。观察并分析两组患者术中平均超声能量和有效超声时间,术前和术后1d,1wk,2mo的最佳矫正视力、中央角膜厚度、房水闪辉细胞,术后2mo的角膜内皮细胞计数变化。

结果：两组患者术前最佳矫正视力、晶状体核硬度分级、中央角膜厚度、术中平均超声能量及有效超声时间均无统计学差异(P>0.05)。两组术后各时间点的最佳矫正视力比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。以各时间点中央角膜厚度与术前中央角膜厚度差值作为各时间点中央角膜厚度变化值,结果显示,术后1d,1wk试验组患者的中央角膜厚度变化小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05); 术后2mo中央角膜厚度变化比较,差异无统计学意义(P>0.05)。术后1d,1wk试验组患者的房水闪辉细胞数低于对照组; 至术后2mo,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。术后2mo试验组角膜内皮细胞丢失率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：小直径撕囊行囊袋内超声乳化能够减少术中超声乳化能量对角膜的损伤,同时减少对血-房水屏障的破坏,患者术后恢复更快。     

In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma

AIM:To reconstruct the lamellar cornea using human amniotic epithelial (HAE) cells and rabbit cornea stroma in vitro using tissue engineering technology.METHODS: Human amnia taken from uncomplicated caesarean sections were digested by collagenase to obtain HAE cells, and the cells were cultured to proliferate. Rabbit corneal epithelial cells were removed by n-heptanol to make lamellar matrix sheets. The second passage of HAE cells were cultured on the corneal stroma sheets for 1 or 2 days, then transferred to an air-liquid interface environment to culture for 2 weeks. Tissue engineered lamellar cornea (TELC) morphology was observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; its ultrastructure was observed by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM); corneal epithelial cell-specific keratin 3 and keratin 12 were detected with immunofluorescence microscopy.RESULTS:HAE cells grew on the rabbit corneal stroma, forming a monolayer after 1-2 days. About 4-5 layers of epithelial cells developed after 2 weeks of air-liquid interface cultivation, a result similar to normal corneal epithelium. Rabbit corneal stromal cells were significantly reduced after one week, then almost completely disappeared after 2 weeks. TEM showed desmosomes between the epithelial cells; hemidesmosomes formed between the epithelial cells and the basement membrane. SEM revealed that the HAE cells which grew on the lamellar cornea had abundant microvilli. The tissue-engineered cornea expressed keratin 3 and keratin 12, as detected by immunofluorescence assay.CONCLUSION: Functional tissue-engineered lamellar corneal grafts can be constructed in vitro using HAE cells and rabbit corneal stroma.     

不同切口同轴白内障超声乳化术的疗效比较

目的：比较2.2mm微小切口与3.0mm切口同轴白内障超声乳化术的手术效果。

方法：选择2012-01/2013-06在我院接受白内障超声乳化联合人工晶状体植入术的年龄相关性白内障患者90例90眼,随机分为两组：2.2mm切口组45例45眼,3.0mm切口组45例45眼,分别行2.2mm或3.0mm透明角膜隧道切口同轴白内障超声乳化术。术后1d; 1wk; 1,3mo随访,观察视力、角膜内皮细胞计数、中央角膜厚度、手术源性散光。

结果：术后1d,2.2mm切口组视力明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),术后1wk; 1,3mo,两组比较无统计差异。两组角膜内皮细胞计数、中央角膜厚度在术后1d; 1wk; 1,3mo均无统计学差异(P>0.05)。两组手术源性散光在术后1d; 1wk; 1,3mo均有统计学差异(P<0.05),2.2mm切口组手术源性散光明显减小。

结论：2.2mm微小切口同轴白内障超声乳化术术后早期提高视力更明显,能明显减少手术源性散光,安全性更高。