巢式RT-PCR检测甲肝疫苗的感染性滴度研究

目的 建立一种快速灵敏特异的检测甲肝疫苗滴度的巢式RT-PCR检测方法。方法 运用巢式RT-PCR法对甲肝疫苗病毒滴度进行检测，并与细胞培养ELISA检测法进行比较。结果 巢式RT-PCR灵敏度和特异性均与细胞培养ELISA检测法相似。结论 巢式RT-PCR是一种简便、快速、灵敏的甲肝病毒检测方法，用于疫苗的常规检测有较好前景。     

一种快速检测乙型脑炎病毒滴度的荧光灶试验方法的建立、验证及应用

目的:建立快速荧光灶试验(fluorescence focus assay,FFA)滴定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的方法,验证该法替代病毒蚀斑法测定乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑减毒活疫苗)滴度的可行性并将该法作初步应用。方法:利用原核表达方式构建JEV非结构蛋白1(...     

冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度FFA法的建立及验证北大核心CSCD

目的:建立并验证荧光灶法(FFA)检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度的可行性。方法:采用FFA分别检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗H1N1型、H3N2型、B型单一病毒收获液病毒滴度,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性和耐用性。结果:该方法专属性良好;准确度回收率均为80%~115%,病毒滴度的试验内及试验间精密度RSD值均<10%;3个型别样品稀释倍数对数与病毒滴度呈线性关系,相关系数R2均>0.98;不同孵育温度的病毒滴度RSD值均<10%,耐用性良好。结论:建立的FFA具有良好的专属性、准确度、精密度、线性及耐用性,可用于冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度检测。     

甲肝减毒活疫苗L-A-1疫苗株的核酸序列测定与比较分析

目的 测定甲型肝炎(甲肝)减毒活疫苗龙甲-1株(L-A-1)核酸序列，了解其减毒和适应二倍体细胞的分子机制，并与其他甲肝病毒株进行比较，得出L-A-1株的一些特点。方法 通过抗原捕获聚合酶链反应(AC-PCR)扩增甲肝病毒减毒活疫苗L-A-1株23代的片段，产物纯化后克隆至T载体并进行序列测定，应用生物信息学软件分析比较。结果 得到了甲肝减毒活疫苗L-A-1株的基因序列(nt25-7418)。L-A-1株开放读码框架(ORF)长6675个核苷酸，编码2225个氨基酸。比较分析表明，该株与国际代表株MBB株和HM175野毒株在核苷酸水平上同源性分别为98．00％和94．00％，在氨基酸水平上同源性分别为98．51％和98．65％。通过与其他细胞适应株、细胞病变株以及减毒株的比较得出：L-A-1株5′非编码区(5′NTR)nt-152、591、646、687处的突变和180-181处插入11个核苷酸以及2B区的m3889(aa1052-Val)处的突变是病毒适应宿主细胞的分子基础；2C区的m4185(aa1152-Lys)处的突变可能参与病毒的减毒过程；由于3A区缺失6个核苷酸(nt5020-5025)从而导致两个氨基酸(Asn、Asp)缺失是病毒适应细胞快速增殖的分子基础。结论 分析了LA-1株的基因序列。得出其适应细胞和减毒的核苷酸位点。     

灭活与减毒两种甲肝疫苗免疫后诱导细胞免疫应答初探

目的 对国内普遍应用的减毒和灭活甲肝疫苗诱导的细胞免疫水平(产生时间、应答水平)进行检测和比较.方法 筛选健康志愿者18人,随机分组后分别接种甲肝减毒活疫苗和甲肝灭活疫苗.按实验程序以周次为时间点采血,用化学发光法对特异性甲肝抗体(HAY-IgG)进行检测;同时收集外周血单个核细胞(PBMC),用特异性甲肝抗原刺激后,以酶联免疫斑点试验(ELISPOT)法检测效应T细胞分泌TH1型细胞因子IFN-γ的情况;用胞内细胞因子染色法测定CD+ T和CD8+T淋巴细胞中分泌IFN-γ的阳性细胞百分比,Lumlnex法检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4等多种细胞因子水平.结果 两种疫苗均可诱导产生特异性抗HAV抗体,且观测期间抗体水平差异无统计学意义.两种疫苗接种初期即可诱导产生病毒特异性T细胞免疫应答反应,同时伴随高水平的效应细胞因子IFN-γ产生.在免疫接种后1-3周,灭活疫苗诱导的细胞免疫应答水平高于减毒疫苗;而在4-6周,减毒疫苗诱导的细胞免疫应答水平明显增高,超过灭活疫苗.灭活疫苗所诱导的细胞免疫应答在加强免疫后明显增强.结论 两种疫苗接种初期均可诱导体液和细胞免疫应答;灭活疫苗加强免疫后可激发记忆性免疫应答.     

一种新型基因芯片技术在人乳头瘤病毒(HPV)高通量基因分型检测的应用研究

目前应用比较多的采用反向点杂交/线性杂交方法的人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测方法,操作比较繁琐.该文通过设计针对29种HPV基因型的引物对和特异性探针,对HPV样品进行PCR扩增后,将反向引物生物素标记的PCR产物与固定在HPV基因芯片上的HPV DNA探针杂交、清洗和酶标显色,再对芯片进行图像分析转化为数字信号、确定HPV型别,建立HPV高通量基因分型方法(HPG).HPV基因芯片大小为0.36 cm2,每个芯片可在96孔板内的小孔中进行杂交和显色.与HCII方法检测的203例样本比较,对13种高危型检测的结果表明,HPG和HCII方法的一致性较好(kappa值0.663),HPG的分析灵敏度更高.显示了高通量快速检测的在大规模流行病调查、疫苗试验和常规诊断的临床应用前景.     

反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血

目的 建立一种简便快速筛查非缺失型α—地中海贫血点突变的反向点杂交(reverse dot blot,RDB)技术。方法 将生物素直接标记在引物上,选择性扩增人α2珠蛋白基因,将PCR产物与固化在膜条上的寡核苷酸探针杂交,洗膜、显色后分析结果。结果 采用生物素标记的引物：Bio—C1和Bio—C3可选择性扩增α2珠蛋白基因,PCR产物长度为1085bp,该标记片段与固相探针构成的反向点杂交检测体系,可以分辨出中国人群中已知的6种非缺失型α—地中海贫血点突变。结论 该反向点杂交检测体系无需巢式PCR扩增,一步选择性扩增的α2珠蛋白基因产物即可用于杂交;无需进行检测标记物(如生物素)反应,而将生物素直接标记在引物上;无需不同的洗膜条件,故较已报道的同类方法更为简单易行。RDB技术可用于快速诊断中国人非缺失型α—地中海贫血点突变。     

运用细胞培养/链特异性逆转录聚合酶链式反应法进行甲肝灭活疫苗的灭活验证试验

目的 建立一种快速灵敏特异的甲肝灭活疫苗的灭活验证方法.方法 运用细胞培养,链特异性逆转录聚合酶链式反应对甲肝灭活疫前进行灭活验证,并与传统的ELISA法及巢式RT-PCR检测甲肝全RNA进行比较.结果 细胞培养,链特异性逆转录聚合酶链式反应法对甲肝灭活疫苗进行灭活验证,结果全为阴性,与传统的ELISA法结果相同.而采用巢式RT-PCR检测甲肝全RNA的方法对甲肝灭活疫苗进行灭活验证,则出现一些假阳性结果.结论 细胞培养/链特异性逆转录聚合酶链式反应法是一种简便、快速、灵敏的甲肝灭活疫苗的灭活验证方法.大大缩短了检测周期,用于疫苗的常规检测有较好前景.     

微板酶联夹心杂交法定量检测人IL-18 mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，定量检测人IL-18mRNN。方法：针对人IL-18mRNA RT-PCR产物—条链的不同区域序列设计—对特异探针，其中一条为捕获探针，5’端为氨基修饰，可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔板内；另一条为检测探针，3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA，进行RT-PCR扩增IL-18 mRNA，产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交，再加入检测探针与已杂交的产物结合，最后经亲和素-辣根过氧化物酶(SAV-HRP)系统检测杂交信号。结果：该法检测IL-18mRNA RT-PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳，重复性良好，且结果数据化。结论：该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适合于PCR扩增产物的定量检测。     

基于立即早期蛋白IE62 建立水痘-带状疱疹病毒感染性滴度检测方法

目的:基于水痘-带状疱疹病毒(VZV)立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点检测技术(ELISpot)建立一种新型的VZV感染性滴度的快速检测方法。方法:应用生物信息学方法设计并合成VZV-IE62蛋白的多肽抗原,牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,筛选和制备抗VZV-IE62单克隆抗体,应用Western blot和免疫荧光法等开展抗体性能评价,继而应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)结合生物素-亲和素放大法建立新型的VZV感染性滴度检测方法,并与经典空斑计数法进行比较。结果:获得抗VZV-IE62的单克隆抗体1B7,应用于ELISpot方法可特异识别VZV感染后的细胞,以之为基础建立了新型的VZV感染性滴度检测方法。相比经典空斑计数法,该方法可显著缩短检测时间(从5至7 d缩短至32 h)检测结果具有较好的一致性。结论:本研究建立了一种新型的基于VZV立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点技术的VZV感染性滴度检测方法(VZV-IE62 ELISpot),具有潜在的转化应用前景,可为VZV的防治研究提供支持。     

甲肝IgM抗体诊断试剂盒在甲肝病毒抗原检测中的应用

将HAV IgM-Ab诊断试剂盒用HAV-Ag标准品调控灵敏度后,用于检测HAV-Ag,并比较快速检测法和常规过夜法两种检测方法的测定效果,以选择在甲肝疫苗生产中,抗原检测的合适方法.经过调控灵敏度后,抗HAV IgM诊断试剂盒完全可以用来检测HAV-Ag.并可以正确评价HAV-Ag滴度,HAV感染性滴度.适用于甲肝疫苗的检定工作.     

用核酸序列分析鉴别甲肝病毒疫苗株与野毒株

目的鉴别在接种甲肝减毒活疫苗（Ｈ２株）后２３天发生的一例甲型肝炎,其病原体是疫苗株还是野毒株。方法用细胞培养、ＩＥＭ等确认病原体,接种普通狨猴检定病毒毒力,测定核苷酸序列分析病毒基因型。结果甲型肝炎的确诊依据有：抗ＩｇＭ（＋）,双份血清ＨＡＶ总抗体效价１６倍增长以及粪便排出ＨＡＶ（郑株）。该粪便悬液攻击普通狨猴后,肝脏呈现持续性组织病理改变,证明郑株是强毒ＨＡＶ。郑株的３个片段共１３７７个核苷酸序列分析表明,与１９８８年上海甲肝流行株合－５２的同源性高达（９８．３０～９９．４０）％,判定为ＩＡ基因亚型,与Ｈ２株疫苗病毒的基因亚型不同。结论该例甲型肝炎是接种甲肝减毒活疫苗中交叉感染野毒株引发的偶合病例,与疫苗接种无关     

Identification of enterically transmitted hepatitis virus particles by solid phase immune electron microscopy

Small 'featureless' viruses (less than 50 nm) are difficult to identify by routine immune electron microscopy techniques, particularly when they are mixed with debris from stool or cell culture extracts. A combination of conventional immune electron microscopy (IEM) and solid phase IEM (SPIEM) methodologies was used to identify hepatitis A virus (HAV) in stool and cell culture extracts and non-A non-B hepatitis (hepatitis E) in stool extracts. Compared with conventional IEM, the modified SPIEM method resulted in a significant increase in the number of particles observed. Several small aggregates, each containing 2-20 particles, were observed scattered randomly within most grid squares. Similar results were seen with stool extracts from hepatitis E (HEV) infections. The SPIEM method is a simple, highly sensitive specific assay that facilitates rapid identification of enteric hepatitis viruses. Several experiments were done to characterize the effects of altered physical environment within the assay and to evaluate potential modifications.     

甲型肝炎减毒活疫苗及灭活疫苗灌胃免疫小鼠后的抗体应答

目的 :测定甲肝减毒活疫苗及灭活疫苗灌胃免疫小鼠后的抗体应答效应。方法 :将活或灭活的甲肝疫苗加或不加明胶 ,经胃免疫小鼠 ,于末次免疫后 2w取血清及肠液 ,用间接ELISA法分别检测其中的特异性IgG和IgA抗体水平 ,并与空白及肌注组比较。结果 :实验组特异抗体水平明显高于肌注组 (P <0 0 1) ;加明胶组的免疫效果较不加者好 (IgG :P <0 0 0 1,IgA :P <0 0 5 )。结论 :甲肝活疫苗及灭活疫苗经消化道免疫小鼠后 ,均可诱导全身及局部的抗体应答 ;明胶有增强抗体产生的作用 ,可作为一种安全、廉价的粘膜佐剂被进一步开发与利用。     

Vaccines inf the prevention of fecal hazards

In addition to the imperative improvement of hygiene standards, vaccines can also be used for the prevention of diseases transmitted by the feco-oral route. Vaccination is essential to protect against poliomyelitis, the eradication of which is targeted through vaccination campaigns using the live, attenuated vaccine in countries where the disease is still endemic and the inactivated vaccine or a combination of both vaccines (mixed schedule) in countries where the disease is under control. The introduction of a specific routine vaccination program against hepatitis A in endemic countries is now starting to be considered. Travellers to these countries must be protected. Among bacterial diseases, only typhoid fever can be prevented by means of an effective vaccine. The difficulties encountered in improving hygiene standards in numerous countries have prompted the WHO to encourage search for new vaccines for the prevention of the diseases transmitted by the feco-oral route. A vaccine against rotavirus that has just been licensed in the USA should permit the global reduction of a significant number of deaths attributable to these viruses. Vaccine prospects for the prevention of hepatitis E are more distant. Several vaccines against Shigella (injectable polysaccharide conjugate vaccine or oral, live, attenuated vaccines obtained by construction of mutant strains) and enterogenic Escherichia coli (oral, inactivated vaccine containing several strains of ETEC and sub-unit B of the cholera toxin), not to mention candidate vaccines against cholera.