人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究

为了对比人脐带组织源间充质干细胞（UC-MSC）与骨髓源间充质干细胞（BM-MSC）的生物学特性,从足月胎儿脐带组织和成人骨髓中分离出间充质干细胞（MSC）。用有限稀释法、流式细胞术、倒置显微镜检及RT-PCR等方法检测UC-MSC和BM-MSC的分离成功率、细胞产量、成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、增殖特性、免疫表型和多向诱导分化能力等并对比性研究二者的生物学特性。结果表明,UC-MSC和BM-MSC的分离成功率均达100%;虽然由脐带组织中分离的有核细胞数低于骨髓（1×10^6/cmvs5.5×10^7/ml）（p=0.0002）,但在培养第14天由脐带和骨髓中得到的贴壁细胞数无差异（8.6×10^5/cmvs8.4×10^5/ml）（p〉0.05）;UC-MSC形态、大多数分子表型、细胞周期状态、脂肪和骨诱导分化能力与BM-MSC相似,但UC-MSC的CFU-F比例（1∶1609±0.18）高于BM-MSC的CFU-F比例（1∶35700±0.01）（p〈0.05）。此外,UC-MSC具有比BM-MSC更强的增殖能力（p〈0.05）。UC-MSCHLA-ABC和CD106分子表达低于BM-MSC（p〈0.05）。结论：脐带组织源间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与BM-MSC的相似,且具有比BM-MSC更高的增殖能力、较低的HLA-ABC和HLA-DR表达,UC-MSC有望成为BM-MSC理想的替代来源。     

新型外周血CD34+细胞动员剂--抗CD49d单克隆抗体的实验研究

为了探讨外周血干细胞动员的新途径，用抗CD49d单克隆抗体和rhG-CSF及二者联合给小鼠皮下注射，动态观察小鼠外周血的白细胞总数和CD34^ 细胞数的变化，并将各种动员方法所获得的干细胞分别进行干细胞移植。结果发现，给予动员剂后小鼠的外周血白细胞总数和CD34^ 细胞比例明显升高，以rhG-CSF和抗CD49d单克隆抗体联合给药效果最佳。移植后各组小鼠均获造血重建，以联合动员组造血恢复速度最快。结论：抗CD49d单克隆抗体能有效动员小鼠外周血干细胞，与rhG-CSF具有协同作用。     

基质细胞衍生因子-1及其受体在G-CSF诱导的造血干/祖细胞动员中的作用

目的探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其特异性受体CXCR4在G-CSF诱导的造血干／祖细胞（HSPC）动员中的作用。方法应用酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫组织化学、流式细胞术等方法检测健康供者稳态及G-CSF动员过程中骨髓、外周血SDF-1／CXCR4的变化，并应用SDF-1中和性抗体阻断BALB／c小鼠SDF-1信号通路，进一步验证SDF-1／CXCR4在动员中的作用。结果G-CSF动员前骨髓和外周血的SDF-1浓度分别为（7．23±0．66）μg/L和（5．43±0．35）μg／L，动员后分别为（5．88±1．03）μg／L和（5．42±0．52）μg/L。动员后骨髓SDF-1蛋白水平下降（P＜0．05），骨髓和外周血之间的SDF-1浓度梯度消失（P＞0．05）；稳态骨髓、动员后骨髓和动员后外周血的CD34^＋ CXCR4^＋细胞在CD34^＋细胞群中的比例分别为（40．98±21．56）％、（65．80±24．68）％和（27．54±26．03）％。动员后CXCR4在骨髓CD34^＋胞上表达增加（P＜0．05），而外周血CD34^＋细胞CXCR4表达降低（P＜0．05）。SDF-1中和性抗体可降低G-CSF动员的BALB／c小鼠外周血成熟白细胞和祖细胞集落数量（P＜0．05）。结论骨髓中SDF-1水平的降低以及CXCR4在HSPC上表达的下降促进了G-CSF介导的动员的发生。     

供体TReg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和造血重建的影响

本研究探讨供体CD4^＋CD25^＋调控T细胞（regulatoryTcell,TReg）输注对异基因骨髓移植（allo-BMT）后小鼠移植物抗宿主病（GVHD）和造血重建的影响。建立C57BL/6→BALB/c小鼠allo-BMT模型,体外磁珠分离纯化供鼠外周血CD4＋CD25＋TReg细胞,接受移植的小鼠随机分为3组,在移植骨髓后6-8小时分别予尾静脉输注CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4^＋CD25^-T细胞和RPMI1640培养液（空白对照）。以移植后GVHD表现,肝、脾、小肠组织病理形态、生存期及白细胞（WBC）、血小板（Plt）的重建为观察指标并进行组间比较。结果显示：TReg阳性细胞移植组,TReg阴性细胞移植组和空白对照组小鼠WBC〉1.0×10^9/L的时间分别为（8.14±3.26）天、（17.62±5.71）天、（19.81±6.77）天;Plt〉20.0×10^9/L的时间分别为（5.29±1.34）天、（8.97±3.44）天、（9.52±3.92）天,TReg阳性细胞移植组WBC和Plt恢复时间比TReg阴性组与空白对照组快（P〈0.05）。3组小鼠在移植后15天GVHD评分为（1.33±0.58）、（1.80±0.27）、（1.93±0.45）,TReg阳性细胞移植组小鼠与TReg阴性细胞移植组、空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。移植后（25-30天）的TReg阳性细胞移植组小鼠肝、脾、小肠GVHD病理损害较同期TReg阴性细胞移植组与空白对照组小鼠有一定程度的减轻。3组小鼠移植后平均存活时间分别为（41.45±17.88）天、（18.75±14.39）天和（25.67±16.84）天,TReg阳性细胞移植组小鼠平均存活时间较TReg阴性细胞、空白对照组小鼠延长（P〈0.05）。结论：小鼠allo-BMT后输注供体TReg细胞可以减轻移植后GVHD程度,延长小鼠生存期,促进造血重建。     

rhG-CSF动员的骨髓和外周血干细胞混合移植物首次采集时供者外周血单核细胞计数反映混合采集物中CD34^＋细胞含量

本研究探讨人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员的骨髓和外周血干细胞混合移植健康供者首次干细胞采集时供者外周血单核细胞数量与骨影外周血混合采集物中CD34^＋细胞数量的关系。对70名亲缘健康供者均皮下注射rhG-CSF5μg／（kg·d）,连续5天。第4天和第5天分别采集骨髓和外周血干细胞。首次干细胞采集时用EX2100血细胞分析仪检测供者外周血细胞计数,同时应用流式细胞仪测定骨髓和外周血混合采集物中的CD34^＋细胞数量。结果表明：rhG—CSF动员的70例供者首次干细胞采集时外周血单核细胞的数量为（1．15±0．60）×10^9／L;骨髓和外周血采集物中的CD34^＋细胞总量分别是（5．854±2．93）×10^7和（1．33±0．77）×10^8;骨髓和外周血混合采集物的CD34^＋细胞总量是（1．92±0．86）×10^8。Pearson和Spearman分析显示首次干细胞采集时供者外周血单核细胞计数（×10^9／L）与骨髓采集物中CD34^＋细胞的总量（相关系数：r=0．265,P=0．027）、外周血采集物中CD34^＋细胞总量（r=0．340,P=0．004）以及混合移植物中CD34^＋细胞的总量（r=0．398,P：0．001）均存在显著的相关性;多因素分析表明,首次干细胞采集时供者外周血单核细胞计数与骨髓采集物、外周血采集物以及混合移植物中CD34^＋细胞的总量均呈正相关关系（P值分别为0．027、0．004和0．001）。首次干细胞采集时供者外周血单核细胞数量对混合移植物中CD34^＋细胞总量预测的敏感性是71％,特异性是70％（P=0．007）。结论：rhG-CSF动员的骨髓和外周血混合移植健康供者首次干细胞采集时外周血单核细胞计数可有效预测输注给受者的CD34^＋细胞总量即采集效果。     

不同来源人造血干/祖细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢能力的差异

目的 比较不同来源的人造血干／祖细胞在NOD／SCID小鼠体内归巢能力的差异性，并探讨其体内归巢能力与膜表面归巢相关分子CXCR4表达水平的相关性。方法 采用流式细胞术（FACS）检测新鲜脐血、冻存脐血、动员后外周血（mPB）及骨髓来源的CD34^＋细胞表面CXCR4表达水平；将荧光染料CFSE标记的人CD34^＋细胞移植人接受照射的NOD／SCID小鼠，移植后20小时检测已归巢于NOD／SCID小鼠骨髓及脾脏中不同来源的人CD34^＋细胞，计算其相应的骨髓及脾脏归巢效率；并将小鼠股骨制成组织切片，荧光显微镜下观察人CD34^＋细胞在小鼠骨髓腔内的分布。结果 新鲜脐血、冻存脐血、mPB和骨髓CD34^＋细胞膜表面CXCR4表达阳性率分别为（49.52±1．12）％。（46．12±2．29）％，（48．50±2．48）％和（65．39±1．27）％，CD34^＋细胞在NOD／SCID小鼠骨髓的归巢效率分别为（3．00±0．44）％，（2．84±0．46）％，（4．06±0．70）％及（5．76±0．52）％；在脾脏的归巢率分别为（1．88±0．12）％，（1．80±0．15）％，（1．90±0．22）％，（2．16±0．34）％。归巢的CD34^＋细胞主要分布于小鼠股骨的骨内膜区域。结论 脐血CD34^＋细胞膜表面CXCR4水平低于mPB和骨髓。经冻存复苏后脐血CD34^＋细胞膜表面CXCR4水平略有下调。脐血CD34^＋细胞在照射NOD／SCID小鼠的骨髓归巢效率低于mPB和骨髓。     

人骨髓间充质干细胞对同种异体调节性T细胞的影响及可能机制实验研究

本研究探讨人骨髓间充质干细胞（human mesenchymalstem cells,hMSC）对同种异体CD4^＋CD25^＋调节T细胞的作用,进一步查明人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫调节作用的可能机制。从人骨髓中分离培养hMSC,通过免疫组织化学方法检测其表面标记并进行鉴定。从非亲缘供者健康人外周血中提取单个核细胞,在IL-2作用下体外培养,实验组加入不同数量级hMSC（1×10^3,1×10^4,1×10^5）共培养5天,对照组加入PBS。于结束培养前18小时经3H-TdR标记后用β液体闪烁计数仪检测T淋巴细胞增殖,流式细胞术检测各组CD4^＋CD25^＋T细胞的百分率,RT-PCR检测各组细胞Foxp3的相对表达量（Foxp3/β-actin）,ELISA分别测定上清中TGF-β、IL-10、IFN-γ和IL-12的表达。Pearson检验分析Foxp3相对表达量与CD4^＋CD25^＋T细胞百分率的相关性,以及Foxp3相对表达量、CD4^＋CD25^＋T细胞百分率与T淋巴细胞增殖程度（counts per minute,CPM值）,细胞因子TGF-β、IL-10、IFN-γ和IL-12表达量的相关性。结果表明：hMSC能明显抑制T淋巴细胞增殖,且抑制作用与hMSC呈剂量依赖性;实验组各组CD4^＋CD25^＋T细胞亚群含量以及Foxp3相对表达水平均较对照组明显增加（p〈0.05）,且实验组间比较差异仍具有统计学意义（p〈0.05）;Foxp3表达水平、CD4^＋CD25^＋T细胞百分率与T淋巴细胞增殖水平呈明显负相关（p〈0.05）,与TGF-β、IL-10表达量呈明显正相关,而与IFN-γ和IL-12的表达无明显相关性。结论：hMSC呈剂量依赖性抑制同种异体淋巴细胞增殖,其机制可能与hMSC通过分泌TGF-β、IL-10促进CD4^＋CD25^-T细胞向表达Foxp3的CD4^＋CD25^＋调节T细胞转化,进而发挥免疫抑制作用有关。     

骨髓增生异常综合征患者外周血树突细胞数量、亚群及其表面协同刺激分子表达的研究

目的 检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血树突细胞（DC）总量、亚群（pDC和mDC）比例及其表面协同刺激分子（CD80、CD86和CIMO）表达，探讨MDS患者细胞免疫异常的形成机制。方法 选取38例MDS患者及19名正常对照，采用荧光素单克隆抗体标记法和流式细胞术检测MDS患者外周血中Lin1^—HLA-DR^＋细胞（DC）、Lin1^-HLA—DR^＋CD123^＋细胞（pDC）、Lin1—HLA—DR^＋CD11c^＋细胞（mDC）的数量以及CD80、CD86和CIMO在DC膜上的表达。结果低危MDS组、高危MDS组和正常对照组外周血DC总量分别为（33．7±7．0）×10^6／L、（56．3±29．0）×10^6／L和（12．1±1．4）×10^6／L（P〈0．05），pDC数量分另U为（12．6±4．1）×10^6／L、（3．6±1．0）×10^6／L和（6．6±0．7）×10^6／L（P〉0．05），mDC数量分别为（16．7±6．3）×10^6／L、（28．7±17．6）×10^6／L和（5．5±0．9）×10^6／L（P〈0．05）。低危MDS组、高危MDS组和正常对照组DC占外周血单个核细胞（PBMNC）百分比分别为（2．37±0．53）％、（3．58±1．39）％和（0．68±0．08）％（P〈0．05），pDC占PBMNC百分比分别为（0．82±0．29）％、（0．31±0．06）％和（0．37±0．04）％（P〉0．05），mDC占PBMNC百分比分别为（0．96±0．35）％、（1．51±0．70）％和（0．32±0．05）％（P〈0．05）。低危MDS组、高危MDS组和正常对照组外周血中CD80^＋DC分别为（30．6±11．8）×10^6／L、（2．3±0．9）×10^6／L和（2．3±0．6）×10^6／L（P〈0．05），CD86^＋DC分别为（25．1±7．4）×10^6／L、（12．4±6．3）×10^6／L和（6．2±3．2）×10^6／L（P〈0．05），CD40^＋DC分别为（2．8±1．0）×10^6／L、（1．5±0．9）×10^6／L和（3．2±2．3）×10^6／L（P〉0．05）。结论 MDS患者外周血中DC数量增多、比例异常；以mDC增多为主，pDC无明显增多；MDS患者DC高表达CD80和CD86，CD40表达不增高。提示MDS患者诱导抗肿瘤细胞免疫的抗原呈递细胞（pDC）数量及功能不足；而与正常造血克隆炎性损伤有关的抗原呈递细胞（mDC）却增多。这可能是导致MDS患者细胞免疫异常的重要机制之一。     

骨髓间充质干细胞对哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞及气道炎症的影响

背景：CD4^＋CD25^＋调节性T细胞功能降低、数量下降已被公认为是哮喘患者免疫失调的重要表现。间充质干细胞具有免疫调节功能，可上调CD4^＋D25^＋调节性T细胞，抑制淋巴细胞增殖，并已在许多免疫性疾病方面成功应用。目的：观察骨髓间充质干细胞移植对哮喘小鼠外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞及气道炎症的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006—09／2008—05在中山大学附属第二医院中心实验室完成。材料：SPF级BALB／c小鼠34只，其中3-4周龄雄鼠4只，用于制备骨髓间充质干细胞：6周龄雌鼠30只，随机分为正常对照组、模型对照组、细胞移植组，10只，组。方法：模型对照组、细胞移植组以500mg/L卵白蛋白溶液0．2mL腹腔注射致敏，以50g/L卵白蛋白溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型。正常对照组以生理盐水代替卵白蛋白溶液，细胞移植组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入体外分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞。主要观察指标：流式细胞仪检测小鼠外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞占淋巴细胞的比例，并检测小鼠支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞总数，计数嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，结合病理切片分析气道炎症情况。结果：与正常对照组比较，模型对照组外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞占淋巴细胞的比例明显降低（t=7．742，P〈0．05）；与模型对照组比较，细胞移植组该比例明显升高（t=-7．455，P〈0．05）。3组小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数比较差异显著（P均〈0．05）：两两比较，模型对照组支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数高于正常对照组（P〈0．05），细胞移植组支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数低于模型对照组（P〈0．05）。正常对照组小鼠气道无明显炎症改变：模型对照组小鼠支气管、血管粘膜下和周围肺组织有明显炎症细胞浸润、气道上皮增生、气道黏液增多、气道上皮部分断裂脱落；细胞移植组小鼠气道炎症明显减轻。结论：静脉输注骨髓间充质干细胞能上调哮喘小鼠外周血CD4^＋D25^＋调节性T细胞比例，同时可一定程度上抑制哮喘小鼠气道炎症。     

rhG-CSF对供者骨髓和外周血采集物中Th17细胞的影响

本研究探讨人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）供者体内应用对骨髓采集物（GBM）和外周血采集物（GPB）中Th17细胞的影响。对25名亲缘供者皮下注射rhG-CSF5μg/（kg.d）,连用5天,于第4、5天分别采集骨髓和外周血,注射前留取部分供者稳态骨髓（steady state bone mavrow,SSBM）和稳态外周血（steady state peripheral blood,SSPB）。采用流式细胞术测定动员前后供者骨髓和外周血中T细胞分泌IL-17的变化。结果显示：rhG-CSF体内应用后供者骨髓中CD4＋T细胞和CD8＋T细胞分泌Il-17的能力较稳态骨髓明显下降（GBM vs SSBM Th17/CD4＋T,0.74%±0.27%vs1.78%±1.19%,p〈0.05;Tc17/CD8＋T,0.19%±0.16% vs 0.36%±0.37%,p〈0.05）,外周血中的变化与骨髓相同（GPBvsSSPBTh17/CD4＋ T,1.82%±0.91%vs3.26%±1.89%,p〈0.01;Tc17/CD8＋T,0.21%±0.17%vs0.44%±0.28%,p〈0.01）。25例供者GBM与GPB相比,GPB中Th17/CD4＋ T和Tc17/CD8＋ T的比值均高于GBM（p〈0.05,p〈0.01）。结论：体内应用rhG-CSF能够抑制供者骨髓及外周血采集物中Th17细胞的产生,它可能是GPB和/或GBM混合移植对GVHD的发生率没有增加的部分原因。     

不同剂量TPO对小鼠骨髓MSC增殖的影响

为了探讨不同剂量血小板生成素（TPO）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖的影响，将20只昆明小鼠（35±5g）随机分为低、中、高3个剂量实验组与对照组：给实验组分别腹腔注射TPO25、50和100μg／kg，而给对照组腹腔注射生理盐水0．1ml／g，每日1次，连用5日：每组分别于最后1次注射后12小时收集小鼠骨髓，计数骨髓有核细胞数（BMNC），以10^6／cm^2接种、培养并计数原代成纤维样细胞集落形成单位（CFU—F），同时对其进行成骨、成脂肪诱导分化，用流式细胞术检测BMNC中CD90^＋、CD105^＋、CD34^＋细胞比例并鉴定CFU—F的表型。结果显示：与对照组相比，实验组所获得的BMNC、CD90^＋、CD105^＋、CD34^＋细胞比例和CFU—F集落数明显增加（P〈0．05）。3个剂量中以50μg/kgTPO组增加最明显，但50μg/kg组的CFU—F集落数与100μg/kgTPO组的CFU—F集落数相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。CFU—F样MSC具有成骨、成脂肪分化的能力。结论：TPO促进BMNC数、CD90^＋、CD105^＋细胞数和CFU—F集落数增多，即促进骨髓MSC的增殖，但是TPO促进骨髓MSC增殖的作用不随剂号的增加而增加．     

体外扩增小鼠造血干/祖细胞及重建造血功能的研究

目的 探讨体内中性粒细胞的快速植入及长期重建造血的能力。方法 分离经氟尿嘧啶处理的雄性BDF1小鼠骨髓单个核细胞，以MoFlo细胞分选系统分离纯化CD34^ /c-kit^ 造血干，祖细胞，体外应用骨髓间充质干细胞共培养和阶段扩增结合的方法分别对分离的单个核细胞和CD34^ /c-kit^ 细胞进行体外扩增，并将扩增的有核细胞移植给经亚致死剂量照射的雌性小鼠。结果 以骨髓间充质干细胞为培养基质细胞，结合分阶段扩增方法，有效提高了各种细胞的扩增倍数，其中单个核细胞扩增的总有核细胞、CD34^ 细胞、GM-CFC和HPP-CFC扩增倍数分别为10．8，4．8，65．9和38．8，CD34^ /c-kit^ 细胞扩增的以上4种细胞扩增倍数分别为76．1，2．9，71．7和51．8；扩增细胞移植后可快速产生体内中性粒细胞的植入，并在2个月后的移植小鼠中仍可检测到移植的造血细胞。结论 与骨髓间充质干细胞的共培养，为造血干，祖细胞的有效扩增提供了良好的环境，分阶段扩增法加快了体外造血干，祖细胞的扩增和成熟，为移植后体内中性粒细胞的快速植入创造了条件。     

急性髓系白血病和非白血病骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

本研究旨在比较急性髓系白血病的间充质干细胞（MSC）、急性髓系白血病完全缓解后骨髓MSC以及非白血病的MSC的三者生物学特性。将骨髓MSC分为3组：白血病组、完全缓解组以及非白血病组。采用光学显微镜观察各组MSC的形态学特征,在原位瑞氏染色后计数各组CFU-F数,计数各组MSC的融合时间,绘制各组MSC的生长曲线,应用流式细胞仪检测各组MSC的免疫表型及细胞周期并计算DI值。结果发现,3组骨髓MSC的形态无差异;3组原代MSC的CFU-F数有差异（P=0．01）,其中白血病组MSC的CFU—F最少;3组原代MSC的融合时间有差异（P〈0．01）,其中白血病MSC组的融合时间最长;在第3、5、7天对3组MSC（第2代）的细胞计数进行比较,结果无显著性差异（P〉0．05）;3组MSC（第二代）免疫表型检测显示CD105、CD106均为高表达,CIM5表达阴性,3组间结果比较无差异（P值分别为0．37、0．50）;各组MSC（第二代）的G0／G1期细胞比例分别为（89．9±4．0）％,（90．2±3．0）％,（91．0±3．0）％,3组比较未显示差异（P=0．79）。3组MSC的DI值都在0．9-1．1范围之内。结论：在对白血病与非白血病的第二代MSC的生物学特性比较中,未发现有显著性差异。     

CD271及CD133用于阳性分选富集骨髓间充质干细胞的比较

本研究旨在通过对CD271（低亲和性神经生长因子受体，low affinity nerve growth factor receptor，LNG—FR）及CD133免疫磁珠阳性分选富集骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的比较，选出一种相对理想的从骨髓中富集间充质干细胞的免疫磁珠分选方法。采用免疫磁珠的方法得到骨髓单个核细胞中的CD271^＋细胞及CD133^＋细胞；将得到的细胞分别进行培养，14天后计数成纤维细胞集落形成单位（colony forming unit—fibro—blast，CFU—F）；对每个传代细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线；取两种方法得到的细胞培养至3代以后，流式细胞术检测细胞表面抗原，通过细胞形态及免疫化学染色鉴定比较成骨及成脂肪定向诱导分化。结果表明：CD271阳性分选纯度为（89．50±0．98）％，CD133阳性分选纯度为（88．03±3．06）％；1×10^4个CD271^＋细胞培养后产生的CFU—F数目是1×10^4个CD133^＋细胞培养后形成CFU—F数目的2倍，CD271^-细胞培养后无CFU—F形成，而CD133^-细胞培养后可形成少量的CFU—F；两种方法得到的细胞培养至第3代后表型基本一致，即CD34^-、CD14^-、CD45^-、CD90^＋、CD29^＋、CD44^＋、CD105^＋、CD73^＋；CD271^＋细胞的增殖能力比CD133^＋细胞的高出3倍，而且具有更强的成骨、成脂肪分化潜能。结论：虽然CD271及CD133阳性分选都可以得到间充质干细胞，但相比之下，CD271阳性分选得到的间充质干细胞有更强的增殖和分化能力，因而CD271阳性分选是一种相对理想的从骨髓中富集阃充质干细胞的免疫磁珠分选方法。     

不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34^＋细胞植入NOD／SCID小鼠的影响

为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞（MSC）对脐血（UCB）CD34^＋细胞移植的NOD／SCID小鼠造血重建的影响，明确最佳的移植时机，将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于UCBCD34^＋细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经^60Coγ射线照射的NOD／SCID小鼠，观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化，并于移植后42天处死小鼠，用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量。结果表明：（1）MSC和UCBCD34^＋细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度，缩短白细胞和血小板恢复时间；二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度，且输注UCBCD34^＋细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者。（2）与单纯UCBCD34^＋细胞移植相比较，不同时相输注MSC均可促进UCBCD34^＋细胞的植入，三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异。结论：人骨髓MSC与UCBCD34^＋细胞共移植时，以同时移植效果最佳，此结果为MSC的临床应用提供了实验依据。     

间充质干细胞对小鼠辐射早期造血组织细胞的细胞周期及凋亡的影响

本研究探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对急性放射病小鼠重要造血免疫器官的早期辐射防护作用及其机制。BALB/c小鼠受5.5Gy60Coγ射线照射后随机分为两组。MSC组照射后1小时内,经尾静脉输注BALB/c小鼠的MSC2.5×107/kg;对照组在照射后输注等体积生理盐水。用流式细胞术检测两组小鼠照射后6、12、24和72小时的骨髓、胸腺和脾细胞的凋亡及细胞周期变化;用免疫组织化学法检测照射后12小时胸腺和脾脏P53蛋白表达情况。结果显示:照射后6小时各器官细胞出现G0/G1及G2/M期阻滞,S期下降。胸腺细胞,脾细胞和骨髓细胞分别于照射后12、6和24小时后发现G0/G1期阻滞峰值,随后G0/G1期细胞减少,S和G2/M期细胞增多,72小时时G0/G1期细胞数低于正常值,S期细胞数高于正常值。胸腺和脾细胞周期改变快于骨髓细胞,改变幅度也大于骨髓细胞。MSC组细胞周期变化速度和程度高于对照组。流式细胞术显示各器官细胞照射后6小时凋亡率明显增加,12小时达高峰,24小时后逐渐降到正常,脾与胸腺细胞凋亡率高于骨髓细胞。MSC组的胸腺细胞照射后12小时、脾细胞照射后12、24小时、骨髓细胞照射后24小时的凋亡率均少于对照组。免疫组织化学检测显示,照射后12小时MSC组小鼠脾脏胸腺细胞P53蛋白表达低于对照组。结论:MSC加快辐射小鼠骨髓、胸腺和脾脏细胞的周期变化,减少细胞凋亡,促进受损的造血和免疫器官修复,从而对受照小鼠起到早期辐射保护作用。     

富血小板血浆优化培养间充质干细胞的实验研究

目的探讨以人富血小板血浆(PRP)取代动物血清培养可供临床应用的间充质干细胞(MSC)的新方法。方法骨髓标本取自行全髋关节置换术的造血功能正常患者的近端股骨。有核细胞2×10~5/cm~2接种于25 cm~2培养瓶中培养 MSC,比较含12.5% 胎牛血清(FCS)和12.5% 马血清的完全 Dexter 培养液,含10.0% FCS 的α-MEM 培养液和含5% PRP 的α-MEM 培养液三种培养体系的扩增效果。有核细胞1×10~6与采自健康供者髂骨的相同数量的骨髓细胞分别接种于25 cm~2培养瓶,14 d 后计数成纤维细胞集落(CFU-F)。结果从近端股骨中分离和扩增的细胞呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定 CD34、CD45阴性,SH2(CD105)、SH3(CD73)、Thy-1(CD90)阳性,体外诱导可向成骨细胞分化。其中含5% PRP 的培养体系较其他两种传统培养方法具有显著增强的 MSC 扩增效果且不改变细胞表型及分化功能;来源于近端股骨的骨髓细胞 CFU-F 较常规髂骨穿刺物显著增高(分别为89±17和16±5,P<0.01)。结论建立以 PRP 取代 FCS 的培养体系,并采用取自外科手术中近端股骨的骨髓标本可在体外高效扩增可备临床细胞治疗应用的 MSC。     

NOD/SCID小鼠脐血单个核细胞骨髓腔内移植的实验研究

目的观察骨髓腔内移植(iBM)人脐血单个核细胞(MNC)对小鼠造血重建和免疫功能恢复的作用。方法NOD/SCID小鼠经137Cs全身照射后,在4h内无菌条件下局部麻醉后从尾静脉或骨髓腔内输注分离脐血MNC。受体小鼠随机分为5组:①对照组:骨髓腔内输注培养液;②阳性对照组(iTV):尾静脉输注脐血MNC3×107/只;③实验Ⅰ组(iBM1):骨髓腔内输注脐血MNC3×106/只;④实验Ⅱ组(iBM2):骨髓腔内输注脐血MNC1×107/只;⑤实验Ⅲ组(iBM3):骨髓腔内输注脐血MNC3×107/只。对照组4只小鼠,实验Ⅱ组7只小鼠,其余每组5只。24h后观察iBM22只小鼠未移植侧胫骨骨髓腔脐血细胞的迁移分布,动态观察移植后小鼠的存活和造血重建情况,7～8周后处死各组小鼠,检测骨髓细胞表面CD分子表达、碳青花(DilCM)染料示踪研究和脐血βactin的DNA标记。结果①照射后骨髓腔内输注脐血MNC,24h后在未输注脐血MNC的一侧胫骨骨髓细胞膜有DilCM标记;②7～8周后小鼠存活14只,其中对照组存活1只,iTV组、iBM1组各存活2只,iBM2组存活4只,iBM3组存活5只;③外周血常规检查结果显示iBM组白细胞的恢复速度比iTV组和对照组快而且稳定;④移植后存活小鼠骨髓细胞表面CD45标记、DilCM染料示踪研究和βactin均显示人源的标记。结论经iBM途径移植脐血MNC至NOD/SCID小鼠骨髓可以重     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性及其支持造血的体外研究

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性,探讨其对体外造血的支持能力,采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,进行细胞形态观察和免疫表型、成骨分化及增殖能力检测,并对骨髓细胞进行成纤维细胞集落（CFU-F）形成分析.对MDS患者的MSC进行贴壁培养,接种脐血单个核细胞（MNC）,以观察细胞数和CFU-GM的变化,作为MDS患者MSC支持造血体外实验.结果表明：来自MDS患者的MSC呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CD34,CD45阴性,SH2（CD105）,SH3（CD73）,Thy-1（CD90）阳性,体外诱导可向成骨细胞分化,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的MSC相当.支持造血的体外实验显示,实验组培养上清中的细胞总数和CFU-GM计数在第2周后均显著低于对照组（P＜0.05）.结论：来源于MDS患者骨髓的间充质干细胞的生物学特性与正常供者的MSCs无差异,但其体外支持造血的功能较后者显著减弱.