β1整合素及细胞骨架结构对Gi蛋白心肌细胞内构型的影响

采用免疫荧光双标记、免疫电镜等方法观察胚胎干细胞系及小鼠胚胎心肌细胞中多种G蛋白细胞内构型特点及其与细胞骨架锚蛋白之间的相关性.结果发现Gi在野生型胚胎干细胞和小鼠胚胎心肌细胞内呈网状分布,且与细胞骨架蛋白分布一致.而在β1整合素基因敲除胚胎干细胞中Gi则呈近似于弥漫样分布,与细胞骨架蛋白的分布无相关性.在G201N细胞,Gi又恢复其特有的网样分布.细胞骨架解聚剂可模拟β1整合素基因敲除所造成的Gi构型改变.提示β1整合素缺失可能通过影响细胞骨架的结构来改变以细胞骨架为支架的某些分子如Gi蛋白的细胞内定位.     

β1整合素及细胞骨架结构对Gi蛋白心肌细胞内构型的影响

采用免疫荧光双标记、免疫电镜等方法观察胚胎干细胞系及小鼠胚胎心肌细胞中多种G蛋白细胞内构型特点及其与细胞骨架锚蛋白之间的相关性。结果发现Gi在野生型胚胎干细胞和小鼠胚胎心肌细胞内呈网状分布,且与细胞骨架蛋白分布一致。而在β1整合素基因敲除胚胎干细胞中Gi则呈近似于弥漫样分布,与细胞骨架蛋白的分布无相关性。在G201N细胞,Gi又恢复其特有的网样分布。细胞骨架解聚剂可模拟β1整合素基因敲除所造成的Gi构型改变。提示β1整合素缺失可能通过影响细胞骨架的结构来改变以细胞骨架为支架的某些分子如Gi蛋白的细胞内定位。     

RBBP6敲除小鼠胚胎致死原因的探讨

目的探索成视网膜细胞瘤基因结合蛋白6（Rb binding protein 6,RBBP6）基因敲除小鼠胚胎致死的原因。方法敲低细胞内源性RBBP6后检测磷酸化组蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX,γH2AX）的蛋白水平,利用免疫组化检测RBBP6-/-小鼠胚胎中γH2AX的蛋白水平,由此分析两者的相关性。结果 RBBP6敲低的细胞中γH2AX蛋白水平显著上调,RBBP6-/-小鼠胚胎中γH2AX的蛋白水平也明显上调。结论 RBBP6-/-小鼠胚胎中γH2AX蛋白水平显著升高,从而引发基因组的不稳定性,是RBBP6-/-小鼠胚胎致死的原因之一,并提示RBBP6可能参与DNA损伤应答。     

G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备

目的：制备G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。方法：利用一个neo基因成功整合到基因组的小鼠品系Smad3^ex8 /-,从其妊娠14d的雌鼠中获取胚胎,先制备小鼠胚胎成纤维细胞,PCR鉴定基因型后,挑选一株neo基因杂合型的小鼠胚胎成纤维细胞,用丝裂霉素C处理即获得G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。结果：利用此方法制备的滋养能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长,在含G418的筛选培养基中能存活1－2周。     

GSDMD基因敲除对内毒素所致小鼠急性肺损伤的保护作用

目的探讨GSDMD基因对内毒素所致小鼠急性肺损伤(ALI)的作用。方法 20只野生型C57BL/6小鼠和20只GSDMD基因敲除C57BL/6小鼠随机分为野生型对照组(WT-sham组)、野生型ALI组(WT-ALI组)、基因敲除型对照组(KO-sham组)及基因敲除型ALI组(KO-ALI组),每组10只。ALI组经气管滴入1 mg/kg脂多糖(LPS)制备小鼠ALI模型,对照组气管滴入等体积的PBS溶液。造模成功后取肺组织和肺泡灌洗液(BALF)。肺组织行HE染色,光镜下完成肺损伤半定量评分,并测量肺组织湿/干重比(W/D);采用BCA法检测BALF中总蛋白含量,ELISA法检测BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平;Western blotting检测BALF和肺组织中焦亡相关蛋白的表达。结果与WT-ALI组相比,KO-ALI组小鼠肺损伤半定量评分及肺组织W/D均明显降低(P<0.01),BALF中总蛋白含量以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平亦明显降低(P<0.05或P<0.01)。基因敲除型小鼠未见GSDMD蛋白的表达和活化。野生型小鼠和基因敲除...     

人oGPCRs与Gi1α的基因融合及其在昆虫细胞Sf9的表达

目的获得人孤儿G蛋白偶联受体（oGPCR）与G蛋白α亚基（Gi1α）的融合基因及其表达蛋白。方法采用RT-PCR法,从人HepG2细胞扩增oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174和Gi1α的完整表达序列,运用重叠延伸PCR法扩增得到人oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174分别与Gi1α的融合基因,将各融合基因与供体质粒pFASTBac1重组,而后分别转化DH10Bac菌株获得杆状病毒穿梭杆粒,制备重组杆状病毒并感染Sf9细胞,收获融合蛋白,经Western印迹鉴定。结果得到了上述oGPCR成员的融合基因oGPCRs-Gi1α,并使之在昆虫细胞成功表达,制备了足量的oGPCRs-Gi1α融合蛋白。结论oGPCR可与Gi1α成功融合,昆虫细胞表达体系是制备融合蛋白的理想手段,为今后深入开展oGPCRs的相关研究提供了保障。     

HepG2肝癌细胞中p24β1水平对高尔基体结构的影响

目的 通过改变人肝癌细胞HepG2中p24β1表达水平,研究该细胞中p24β1表达水平是否对高尔基体产生影响。方法 利用RNA干扰实验敲低HepG2细胞中p24β1表达（HepG2-KD）,通过Western印迹检测蛋白干扰效率,实时荧光定量PCR(qPCR)验证转录水平;通过CRISPR/Cas9基因编辑系统构建同源染色体双敲除p24β12基因的HepG2细胞系（HepG2-KO）,在基因组测序和Western印迹检测敲除表型后,通过CCK-8实验和克隆形成实验比较HepG2-KO与HepG2的细胞增殖活性;利用细胞免疫荧光实验分析高尔基体标志物α-N-乙酰半乳糖胺残基在细胞中的分布是否受p24β1水平影响。结果 RNA干扰后能使HepG2细胞中p24β1基因的表达下调;成功构建了同源染色体双敲除p24β1的HepG2-KO细胞系,其细胞增殖活性较HepG2无明显差异;在HepG2-KD和HepG2-KO细胞中,高尔基体呈弥散分布,并伴随片层状顺式高尔基体形态改变。结论 在肝癌细胞HepG2中,p24β1水平对于稳定高尔基体的结构至关重要,提示其对高尔基体功能具有重要调控作用。     

不同强度运动对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌葡萄糖运载体4表达的影响

目的:探讨不同强度运动对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌葡萄糖运载体4(GLUT4)基因和蛋白表达的影响。方法:野生和AMPKα2基因敲除小鼠各30只,并分别随机分为安静对照组、低强度(12m/min)跑台运动组和高强度(20m/min)跑台运动组,每组10只。运动时间均为1小时。运动后即刻取材,测定骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达、AMPKα2蛋白表达以及肌糖原、血糖、血清胰岛素水平。结果:无论野生型还是AMPKα2基因敲除小鼠,1小时不同强度一次性跑台运动后GLUT4 mRNA含量与安静组相比均显著增加。无论安静状态或1小时不同强度跑台运动后,AMPKα2基因敲除小鼠GLUT4基因和蛋白含量与野生小鼠相比均无显著差异。1小时不同强度跑台运动后,AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌肌糖原含量均显著低于野生鼠。野生或AMPKα2基因敲除小鼠,低强度跑台运动组血糖含量显著低于安静组,而高强度跑台运动组与安静组相比无显著差异。结论:不同强度一次性运动后,敲除AMPKα2基因虽然影响了运动小鼠肌糖原的消耗,但未影响骨骼肌GLUT4基因和蛋白含量变化,提示AMPKα2可能并非是一次性运动诱导的骨骼肌GLUT4蛋白和基因含量变化的唯一调节信号。     

整合素和细胞骨架在细胞力传导中的作用

整合素和细胞骨架在力信号转化为细胞内生化信号，进而引发相应的生理或病理反应中起着重要作用。同时，细胞外基质（ECM）－整合素－细胞骨架（CSK）轴系统与膜离子通道，信号传导系统之间具有密切的联系和相互作用。     

成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠发生骨质硬化症

目的:研究Pten基因及其介导的PI3K/AKT信号通路在骨代谢平衡过程中的作用并建立相应的骨代谢疾病小鼠动物模型.方法:在利用Cre-LoxP系统获得成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠的基础上,利用X线摄影术、骨密度分析及组织学染色方法分析Pten基因敲除小鼠较野生型小鼠的骨量变化情况,进一步提取2种基因型小鼠骨组织RNA,通过实时定量PCR分析成骨细胞的标志基因如胶原Ⅰ、碱性磷酸酶、骨钙素等标志分子的表达情况.结果:获得了成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠,Pten基因敲除后小鼠的体型较野生型小鼠没有明显改变,但X线片、骨密度及组织学分析均表明Pten敲除小鼠骨量明显增加,发生了与人类骨质硬化症相类似的表型:此外,实时定量PCR的分析结果显示,成骨细胞的标志基因如胶原Ⅰ、碱性磷酸酶、骨钙素等标志分子的表达都有明显的升高.结论:成功地建立了Pten基因敲除骨质硬化症小鼠动物模型.     

慢性缺氧时心脏κ-阿片受体对β-受体信号的调节作用

为研究慢性缺氧时κ—阿片受体对β—受体信号的调节作用及机制,用光谱荧光法测定电刺激引起的细胞内[Ca^2 ]i瞬变,用RT—PCR测定κ—阿片受体mRNA的表达,用Western blot观察缺氧后G蛋白的变化。结果显示,κ—阿片受体选择性激动剂U50488H可明显抑制β—受体激动剂异丙肾上腺素增加[Ca^2 ]i瞬变幅度的作用,慢性缺氧后,该作用明显减弱;κ-阿片受体mRNA的表达和Gi蛋白的活性在慢性缺氧后无明显改变,而小Gs蛋白的活性明显降低。提示κ—阿片受体对β—受体信号的负性调节作用在慢性缺氧后显著减弱。其机制可能部分与介导β—受体信号的Gs蛋白的活性降低有关。     

整合素β-1对绒毛膜癌细胞耐药的影响

目的:探讨耐药绒毛膜癌细胞粘附分子β-1整合素的表达以及其对细胞凋亡的影响,并寻找逆转耐药的途径.方法:采用人绒毛膜癌细胞株JER及耐足叶乙甙细胞株JEG,免疫组化方法检测绒癌细胞和耐药细胞β-1整合素的表达;MTT法、TUNEL法检测其对细胞凋亡的影响.结果:敏感细胞JER、耐药细胞JEG中均有β-1整合素的表达,但耐药细胞的β-1整合素表达总体水平高于敏感细胞(P<0.01);在敏感细胞及耐药细胞中加入纤维粘连蛋白FN其凋亡率与未结合FN的细胞相比有明显差异(P<0.01);在敏感细胞及耐药细胞中加入抗β-1整合素抗体阻断细胞与β-1整合素的结合,同时加入纤维粘连蛋白FN,其凋亡率与只加入FN时相比差异有显著性(P<0.01).结论:耐药绒癌细胞β-1整合素表达增加,成为耐药表型;其机制主要通过抑制细胞凋亡产生耐药;阻断其作用可以逆转肿瘤耐药.     

去泛素化酶Otulin基因心内膜敲除小鼠模型的构建及表型初步分析

目的 构建心内膜条件性敲除去泛素化酶Otulin基因小鼠模型,初步分析该模型小鼠的表型。方法 Cre?loxP重组技术构建心内膜条件性Otulin基因敲除小鼠模型;PCR技术明确Otulin基因敲除小鼠的基因型;统计分析敲除小鼠出生情况并观察其生长发育状态：超声监测小鼠心脏功能,全自动血液分析仪测定血液中细胞组分变化,苏木素?伊红（HE）染色评价小鼠各器官组织的病理改变。结果 心内膜特异性Otulin基因敲除小鼠模型成功构建;该条件性敲除小鼠可正常交配繁殖,子代基因型比例遵循孟德尔遗传定律;与同窝对照小鼠相比,该条件性敲除小鼠体型较小,体重减轻,脾明显肿大,血液中的炎性细胞数量显著增加,并且心脏组织三尖瓣缺损,心功能衰减。结论 成功构建心内膜特异性Otulin基因敲除小鼠模型,该模型小鼠心脏功能受损且有明显的炎症反应。     

ALK3基因在心肌细胞凋亡中的作用研究

目的 研究心脏特异性骨形态形成蛋白受体IA(BMPR1 A,又名ALK3)基因敲除小鼠心肌组织中的细胞凋亡情况,探讨ALK3基因在心肌细胞凋亡过程中的作用及细胞凋亡与室间隔缺损的关系. 方法 实验分为纯合子小鼠(α-MHC Cre+/-,ALK3 F/-),杂合子小鼠(α-MHCCre+/-,ALK3 F/+)和野生型小鼠(C57)3组,每组取5只.20只雌性α-MHCCre+/-,ALK3+/-小鼠和20只雄性ALK3 F/F小鼠交配获得心脏特异性ALK3基因敲除的纯合子小鼠(α-MHC Cre+/-,ALK3 F/-)和杂合子小鼠(α-MHC Cre+/-,ALK3 F/+);雌性和雄性C57小鼠各10只交配获得子代野生型小鼠;均取13.5d胚胎.提取胎膜DNA,PCR鉴定基因型.光镜下HE染色显示心脏组织形态,透射电镜观察心肌细胞的超微结构和凋亡情况,并以脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡率. 结果 光镜显示α-MHC Cre+/-,ALKS F/-小鼠存在室问隔缺损现象,α-MHC Cre+/-,ALK3 F/+小鼠和C57小鼠心脏形态正常;透射电镜和TUNEL提示α-MHC Cre+/-,ALK3 F/-小鼠心肌细胞凋亡现象较α-MHC Cre+/-,ALK3 F/+小鼠和C57小鼠严重. 结论 ALK3基因在调控心脏发育和心肌细胞凋亡过程中起重要作用.心脏特异性ALK3基因敲除小鼠中,室间隔缺损可部分归因于心肌细胞的过度凋亡.     

模拟微重力条件下昆明小鼠早期胚胎体外发育及其G6PD基因表达

目的 研究模拟微重力条件下培养的小鼠早期胚胎体外发育与1g重力条件下体外发育的差异。方法 检测葡萄糖代谢关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）在昆明小鼠早期胚胎体外不同重力条件下培养各个时期基因的转录与表达。结果 模拟微重力培养条件下,胚胎体外发育受到明显的抑制,模拟微重力不利于小鼠胚胎的体外发育。用CZB＋10％FCS进行培养,2-细胞期培养的囊胚率为零,显著低于常规培养的23．92％;4-细胞期培养的囊胚率为18．44％,显著低于常规培养的80．12％。利用G6PD的内、外两对引物,检测昆明小鼠早期胚胎体外发育各个阶段的G6PD基因的转录与表达。从2-细胞期开始体外常规培养的胚胎,发育至4-、8-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚及退化囊胚都有G6PD基因的转录与表达。在模拟微重力条件下,从2-细胞期开始培养的胚胎,发育至4-细胞期、桑椹期、囊胚期胚胎和退化桑椹胚皆有G6PD基因的转录和表达,而退化的2-细胞胚胎没有检测到G6PD基因的转录与表达。结论 两种培养方式之间,G6PD基因的转录与表达不存在差异,说明早期胚胎都存在磷酸戊糖途径。     

人胎儿不同发育时期皮肤β1整合素、角蛋白19,10表达特征及其与创面无瘢痕愈合关系的研究

目的 观察不同发育时期人胎儿皮肤表皮干细胞和短暂扩充细胞分布、增殖分化特征，并探讨这些特征与胎儿表皮再生的关系。方法 分别取21例不同胎龄（11－31周）全层皮肤，用免疫组织化学SP法观察β1整合素、角蛋白19（K19）和角蛋白10(K10)的表达特征。结果 全部标本表皮基底层细胞均为β1整合素和K19阳性细胞。11－31周的表皮外层可观察到K10阳性细胞。随胎龄增加，K10阳性细胞层数逐渐增多。结论 人胎儿期表皮基底层增殖细胞主要为表皮干细胞和短暂扩充细胞。随胎龄增加，终末分化细胞的比例明显增高。这可能与胚胎早期胎儿皮肤创面无瘢痕愈合有关。     

去分化来源表皮干细胞的分离、培养和鉴定

目的 分离培养去分化来源的表皮十细胞(dedifferentiation-derived epidermal stem cells,DDESCs),并进一步观察其表型特征.方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮十细胞后,移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,移植5 d后收集皮片制备单细胞悬液,流式检测CK10、CK19和β1整合素阳性细胞白分数,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内DDESCs,并采用免疫荧光法和荧光定量PCR法分别检测去分化细胞内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达.结果 流式检测结果表明,皮片移植5 d后,CK10阳性细胞减少(P＜0.01),CK19和β1整合素阳性细胞增加(P＜0.01).Ⅳ型胶原粘贴分离DDESCs,结果表明,移植皮片组在10 min内约有4.56%的贴壁细胞出现.细胞的表型分析结果表明,DDESCs内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达量类似于原始表皮干细胞(P＞0.05),但明显高于成熟表皮细胞(P＜0.01).结论 DDESCs的表型特征与原始表皮干细胞相类似,提示去分化细胞有可能代替原始表皮干细胞应用于创伤部位的修复和再生.     

去分化来源表皮干细胞的分离与鉴定

目的 分离培养和鉴定去分化来源的表皮干细胞.方法 采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞,采用Ⅳ型胶原黏附法分离获得去分化来源的表皮干细胞.观察去分化来源表皮干细胞的形态及增殖特点,并通过免疫细胞化学、免疫荧光及流式细胞技术对其形态和表型进行鉴定.结果 去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、CK19、CK14等,而CK10的表达为阴性.激光共聚焦检测显示a6整合素和CD71在去分化来源表皮干细胞及其亚群中的分布均存在着区域性差异.此外,流式细胞检测结果显示去分化来源的表皮干细胞中主要包含a6+CD71-和a6+ CD71+的两种细胞群落,分别占被检测细胞总数的24.52%±7.88%及66.97%±5.04%.结论 去分化来源的表皮干细胞与机体自身来源的表皮干细胞在形态和表型上具有相似性,可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究.     

低分子量肝素减少局灶节段性肾小球硬化鼠足细胞的脱落

目的观察整合素α3β1、α-肌营养不良蛋白聚糖（α-DG）在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）大鼠肾小球的表达以及低分子量肝素（LMWH）对它们的影响。方法制备FSGs大鼠模型,随机将动物分为FSGS组、治疗组,另设对照组。治疗组给予LMWH410U·kg^-1皮下注射,2次／d。8周后,检测各组24h尿蛋白定量（TP）、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CysC）、肾小球硬化指数（GSI）;检测尿沉渣足细胞特异性标志蛋白podoealxin（PCX）,尿PCX荧光细胞即为尿液足细胞（UPC）;免疫荧光检测肾小球整合素α3β1、α—DG表达分布。分离肾小球,Westem印迹法检测肾小球整合素α3β1、α-DG蛋白表达水平。光镜下观察肾组织病理改变。结果LMWH组TP、CysC、GSI以及病理改变较FSGS组明显改善。正常大鼠整合素α3β1、α-DG主要沿肾小球血管袢呈线性表达;FSGS组肾小球整合素α3β1、α-DG表达比对照组明显减弱;LMWH组整合素α3β1、α-DG表达较FSGS组明显增加。结论LMWH可以减少FSGS肾病大鼠尿蛋白,改善肾脏病理变化,保护肾功能。上调整合素α3β1、α-DG的表达,减少足细胞的脱落。     

耐辐射球菌pprI基因对γ射线损伤小鼠的抗辐射机制

目的 研究耐辐射球菌pprI基因活体电转染在哺乳动物γ射线放射损伤中发挥抗辐射作用的机制.方法 采用雄性昆明种小鼠,随机区组法分为健康对照组、单纯照射组、空载体转染组和基因转染组.将自行构建的含有pprI基因的pCMV-HA-pprI质粒注入接受6 Gyγ射线照射的小鼠肌肉内,然后采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,应用Western blot法对PprI蛋白及其下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物Rad51以及Rad52蛋白表达进行检测.结果 照后1d基因转染组小鼠肌肉组织中PprI蛋白明显表达,7d后未见蛋白表达,其余组小鼠未见蛋白表达;在基因转染组小鼠,肺脏Rad51蛋白于照后第1、7和14天明显表达,明显高于单纯照射组及空载体转染组小鼠,肝脏Rad51蛋白于照后第1天和第28天明显表达,肾脏Rad51蛋白于照后第1天及第14天明显表达;在各组小鼠的肺脏、肝脏组织中检测了Rad52蛋白,其表达无明显规律.结论 耐辐射球菌pprI原核基因成功地在哺乳动物体内细胞表达了PprI蛋白,并作用于下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物rad51基因,使其蛋白表达显著增高而发挥其抗哺乳动物辐射损伤的作用.