卡地腐霉Pr1蛋白酶cDNA片段的分离和克隆

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉（Pythium carolinianum(Pr1)蛋白酶（subtilisin-like protease)的cDNA片段。方法：用1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝30h，然后按下述流程操作；抽提菌丝的总RNA；逆转录合成cDNA第一链；根据Pr1的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物，以cDNA第一链为模板，用MOPAC方法（Mixed oligonucleotides primed amplification of cDNA)扩增cDNA；将扩增产物纯化，连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α用于测序。结果：所获片段中，1个530bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性，尤其与真菌Aphanomyces astaci(卵菌纲，水霉目）的Pr1在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性。分别为59%和49%，此序列已登录Genbank数据库，检索号；AF499006，P.carolinianum与A.astaciPr1部分cDNA序列的比对亦登录Genbank数据库，检索号：AY094976，AY094977。结论：这-DNA片段可能是卡地腐霉Pr1蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段，并加以证实。     

锅柄聚合酶链反应法扩增贵阳腐霉Pr1基因上游未知序列

目的：在灭蚊真菌贵阳腐霉Pr1基因已知序列的基础上,利用锅柄聚合酶链反应法扩增Pr1基因上游未知序列。方法首先采用限制性内切酶BamHⅠ对基因组DNA进行完全酶切,用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后,与5′磷酸化的寡核苷酸链连接,经过变性、链内退火和聚合酶延伸形成锅柄状,最后进行嵌套式PCR。结果获得了Pr1基因已知序列上游864bp核苷酸序列,GenBank登录号为：JQ975036。结论锅柄聚合酶链反应法可以高度有效地扩增与已知位点相邻的基因组片段,是一种可靠的染色体步移法,有利于Pr1基因全长的克隆。     

大链壶菌和卡地腐霉的 Pr1和Pr2类蛋白酶的研究

目的：证实灭蚊真菌大链壶菌和卡地腐霉经诱导可产生枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶（Prl）和胰蛋白酶类蛋白酶（Pr2）。方法：采用特异性底物测定、X光胶片印迹试验、含底物的硝酸纤维薄膜试验等多种方法对蚊虫体壁类似物--几丁质诱导前后培养液中酶的活性进行检测和比较。结果：大链壶菌和卡地腐霉均可产生Pr1和Pr2类蛋白酶。并且，经几丁质诱导30-60h后，卡地腐霉产生的Pr1和Pr2类蛋白酶及大链壶菌产生的Pr2类蛋白酶活性均明显增高。并通过对培养液进行冷冻干燥、等电聚焦电泳和脱盐等处理，对该蛋白酶进行了初步纯化。结论：大链壶菌和卡地腐霉均可产生Pr1和Pr2类蛋白酶。几丁质对这些类蛋白酶的释放有诱导作用。     

灭蚊真菌-卡地腐霉蚊虫宿主范围初探

目的：调查和探讨灭蚊真菌．卡地腐霉的蚊虫宿主范围。方法：野外采集蚊幼虫标本，通过形态鉴定其种属，在实验室按标准化方法测定卡地腐霉对其感染能力。结果：野外5处采集蚊虫标本约600只，受感染蚊虫分属2属7种，加上原有调查资料，到目前为止，已知卡地腐霉的蚊虫宿主共3属12种，内含重要疾病媒介蚊虫3种。结论：本研究初步给出了卡地腐霉在常见蚊虫特别是媒介蚊虫中的灭蚊谱。     

灭蚊真菌卡地腐霉产生游动孢子所需条件的研究

目的：观察卡地腐霉产生游动孢子所需的环境条件。方法：以卡地腐霉经诱导产生的游动孢子数量为指标，观察不同条件对其产生游动孢子的影响，确定该真菌产生游动孢子所需的最适条件。结果：卡地腐霉产生游动孢子的适宜温度范围为10-30℃，最适温度为24—26℃；适宜产孢的蒸馏水pH值范围为5—12，最适pH值为9—11；8d的培养物产孢量最多；菌块与蒸馏水的比例为1：40时产孢最多；三种光照周期对卡地腐霉的产孢影响不大，紫外线对产孢有抑制作用；NaCl、(NH4)2S04、蛋白胨和葡萄糖对游动孢子的产生有较强抑制作用，产孢能力对尿素的耐受性极大。结论：本观察所得资料对卡地腐霉的基础研究和应用都有重要价值。     

贵阳腐霉几丁质酶的活性及基因片段克隆与序列

目的: 研究贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)几丁质酶的活性及其基因片段的克隆与序列分析.方法: (1) 采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定贵阳腐霉分泌的几丁质酶活性;(2)根据NCBI Protein 数据库中多种生物的几丁质酶氨基酸序列的保守区设计引物,以贵阳腐霉基因组DNA为模版,通过PCR扩增获得特异性DNA片段;(3)将该片段克隆并进行测序分析.结果: 贵阳腐霉经诱导后可以分泌几丁质酶.诱导24 h是该酶分泌高峰期.克隆到一207bp的DNA片段,其第182～207碱基序列与狗(Canis familiaris)的几丁质酶基因的部分序列相同.结论: 本实验证明贵阳腐霉核DNA含有几丁质酶基因,在几丁质类似物的诱导下,该菌可以分泌几丁质酶.所克隆的DNA片段可能是几丁质酶基因的部分序列.     

贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达

目的:实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease, Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达,验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员.方法:(1)提取贵阳腐霉总RNA,以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增Pr1基因ORF片段;(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,转化表达菌株E.coli ER2566,IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶.结果:成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达.结论:证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区.     

贵阳腐霉Pr1蛋白酶的诱导条件研究

目的: 了解不同诱导条件对贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)产生Pr1酶的影响.方法: 观察了不同诱导物、不同菌丝接种量、不同初始pH对贵阳腐霉产生Pr1酶的影响.结果: 发现在无诱导物培养液中,无Pr1酶活性.以虾壳为诱导物,在1%菌丝接种量时,产生的Pr1酶活力较高,初始pH对贵阳腐霉产生Pr1蛋白酶的影响不大.结论: 了解了贵阳腐霉产生Pr1酶的最适条件,为以后研究贵阳腐霉提供参考.     

贵阳腐霉类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)的纯化与部分特性研究

目的:纯化灭蚊真菌贵阳腐霉胞外蛋白酶类枯草杆菌蛋白酶,并测定其分子量.方法:培养贵阳腐霉菌丝体,用几丁质诱导,使其产生大量胞外酶,对其产酶条件进行了部分优化.将粗酶液经过脱盐,浓缩进一步纯化,再过Sephadex G-100柱子层析并进行SDS-PAGE,分离类枯草杆菌蛋白酶.结果:(1)以几丁质为唯一碳氮源,在26℃,初始pH值6.0,1%的菌丝接种量为最佳诱导条件;(2)分离得到的类枯草杆菌蛋白酶,并测定其分子量约为33kDa.结论:类枯草杆菌蛋白酶纯化成功,结果较理想,为进一步研究提供依据.     

rDNA ITS区间PCR-RFLP在腐霉属11菌株快速鉴别中的应用

目的：将灭蚊腐霉Pythium sp.与从猝倒、茎腐植株分离到的9个病原真菌相鉴别。方法：以瓜果腐霉作阳性对照。以ITS1和ITS4为引物，采用PCR方法对待测菌株的rDNA ITS区进行了扩增，再用4种限制性内切酶（TaqⅠ，HinfⅠ，Hin6Ⅰ，MboⅠ）进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后得到RFLP图谱，利用Nei et al的片段比较方法计算菌株间相似程度，NTSYS-PC软件包进行聚类分析。结果：对11个菌株进行了快速鉴别，证明从受感染的植物菌株上分离到的真菌主要是瓜果腐霉，与灭蚊腐霉Pythium sp.有明显区别。结论：rDNA ITS区的PCR-RFLP可用于真菌的快速鉴别。