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1.
目的:构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/abl mRNA和P210蛋白的影响。方法:根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA(siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr/abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果:构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr/abl mRNA的相对水平下降50%,使P210蛋白下降47%。结论:bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。 相似文献
2.
目的:构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr/abl mRNA的siRNA真核细胞表达载体,探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法:根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tusehl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER/shRNA1、pTER/shRNA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果:构建慢性粒细胞白细胞bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER/shRNA1、pTER/shRNA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论:抗慢性粒细胞白细胞bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。 相似文献
3.
目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖. 相似文献
4.
bcr/abl融合基因对β1整合素和L-选择素基因表达的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 研究ber/abl融合基因对β1整合素和L-选择素表达的影响。方法 应用半定量RT-PCR方法检测ber/abl融合基因阴性和阳性的慢性髓系白血病(CML)细胞中β1整合素和L-选择素mRNA的表达水平。同时观察酪氨酸激酶抑制剂Rb-C-Box基因转染bcr/abl基因阳性细胞后β1整合素和L-选择素mRNA表达水平的变化。结果 在bcr/abl基因阳性细胞中,L-选择素mRNA表达水平明显低于ber/abl阴性细胞,转入Rb-C-Box基因后,L-选择素mRNA的表达水平与ber/abl阴性细胞相似。bcr/abl阴性和阳性细胞及转染Rb-c-Box基因细胞中β1整合素mRNA表达水平差异均无显性。结论 ber/abl融合基因可抑制CML细胞中L-选择素mRNA的表达,对β1整合素mRNA的表达影响较小。 相似文献
5.
RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi),抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达,在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT),转导入肝癌细胞7721,在瘤细胞内诱导RNAi,采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37.5%;细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加;hTERT基因的mRNA表达由99.4%下调到53.1%,其蛋白表达由86.3%下调到46.6%。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。 相似文献
6.
本研究旨在探讨Survivin基因在淋巴瘤细胞中的生物学作用,为将来以Survivin为靶点治疗套细胞淋巴瘤提供实验室证据。体外化学合成针对survivin mRNA基因的siRNA片段,通过DMRIE-C转染Jeko-1细胞,以无关siRNA、未转染的细胞为对照,采用RT-PCR和Western blot方法检测siRNA的抑制效果,利用流式细胞术检测细胞的凋亡率,用CCK-8法检测转染24、48、72 h对细胞增殖的影响。结果表明,与未转染的空白组相比,siRNA转染Jeko-1细胞后24、48、72 h survivin mRNA的相对表达量分别为0.49±0.03、0.38±0.02和0.17±0.02;细胞增殖抑制率分别为(31.2±2.1)%、(43.3±3.4)%和(52.6±2.5)%;细胞凋亡率分别为(6.3±0.5)%、(13.5±1.1)%和(23.6±1.6)%;survivin蛋白表达水平逐步减低。结论:靶向survivin的siRNA能在体外特异性下调目的基因survivin mRNA和蛋白的表达,表现出抑制Jeko-1细胞增殖和促使其凋亡的生物学效应,survivin基因有望成为淋巴瘤治疗的一个药物靶点。 相似文献
7.
目的探讨RNA干扰沉默RIP1基因表达对人大肠癌Lovo细胞生物学行为的影响。方法将人大肠癌【刖。细胞常规分为空白对照、阴性对照组和实验转染组。体外化学合成RIP1基因序列特异性小干扰RNA(siRNA),Hegene介导转染人大肠癌细胞株Lovo细胞;采用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测特异性siRNA对RIP1基因在mRNA水平上沉默效果;转染后采用噻唑蓝(MrI’r)比色法检测siRNA对细胞增殖的影响;流式细胞周期法检测siRNA对细胞周期的影响;Transwell试验体外检测细胞迁移和侵袭能力。结果成功转染RIP1siRNA的大肠癌Lovo细胞,RT-PCR显示RIP1mRNA和蛋白表达在相应的癌细胞中明显下降;与阴性对照组比较,细胞增殖明显抑制(P〈0.05);GO~G1期细胞[(54.68±1.54)%]明显多于阴性对照组[(48.48±1.96)%]和空白对照组[(43.92±1.68)%];RNA干扰明显抑制Lovo细胞迁移力和侵袭力(21±2.731掷.43±2.064)。结论RIP1siRNA可有效抑制大肠癌Lovo细胞RIP1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞增殖。促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,RIP1siRNA能有效调控Lovo细胞恶性生物学行为。 相似文献
8.
本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性siRNA转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。 相似文献
9.
人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响 总被引:3,自引:1,他引:3
目的:探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法:构建靶向hTERT的siRNA表达质粒转染A549细胞,通过Western blot检测蛋白的表达水平,确定有效后,通过Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定转染后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡率。结果:成功构建靶向hTERT的siRNA表达质粒。实验组siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱(P<0.01),生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),且表现出时间依赖性。流式细胞术测定显示,实验组siRNA转染48h后,肿瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生。 相似文献
10.
bcr/abl mRNA反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病Ph~ 细胞的作用 总被引:3,自引:0,他引:3
Ph~ 慢性粒细胞白血病(CML)的bcr/abl融合基因在其发病机制中具有重要作用。为研究bcr/abl反义寡核苷酸对CML细胞的作用,将合成两种18个碱基的bcr/abl硫代反义寡核苷酸与相应CML细胞系(K562细胞)及患者细胞共同孵育。结果发现,bcr/abl反义寡核苷酸可明显抑制K562细胞生长;对CML细胞CFU-GM抑制率为54%—91%,部分病例CFU-GM可有bcr/abl mRNA消失而PCR检测为阴性。上述抑制都是序列特异性的,与剂量呈正相关关系。通过流式细胞仪PI染色分析DNA含量,检测具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量,发现反义寡核苷酸诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本实验为bcr/abl反义寡核苷酸CML基因治疗及体外骨髓净化提供了依据。 相似文献
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切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:研究bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病(CML)中的作用以及探索CML基因治疗的可能性。方法:合成针对bcr/abl融合基因转录本b3a2断裂点“锤头状”核酶的cDNA序列,定向克隆于逆转录病毒载体内,通过脂质体介导的DNA转染法,将核酶基因导入K562细胞,并通过克隆分析法、流式细胞术(FCM)、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、DNA电泳及电镜观察等方法检测核酶对K562细胞的影响。结果:①核酶转染K562细胞后48小时克隆形成抑制率达85%;②细胞内P210蛋白合成受到明显抑制;③RTPCR半定量检测bcr/ablmRNA表达水平明显下降;④核酶处理组K562细胞发生凋亡,表现为:在FCM图谱上可见明显的凋亡峰;DNA电泳分析出现典型的梯状DNA带;电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论:核酶基因通过逆转录病毒载体导入K562细胞后可成功表达,使K562细胞bcr/ablmRNA及P210蛋白表达水平下降,抑制K562细胞增殖,同时诱导K562细胞发生凋亡。 相似文献
12.
本研究旨在探讨线粒体途径在慢性髓系白血病(CML)信号转导中的作用。用脂质体转染法将bcr3/abl2反义寡核苷酸(ASO)导入CML细胞系K562细胞中;用MTr法检测bcr3/abl2 ASO对K562细胞活力的影响;流式细胞术(FCM)分析测定细胞凋亡率;荧光染料罗丹明123染色分析细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;Western blot检测线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白细胞色素C(CytC)的表达。结果表明,2μmol/Lbcr3/abl2 ASO与K562细胞作用24小时后,可明显抑制K562细胞活力,其抑制率为65.7%;可诱导细胞凋亡,凋亡率为16.9%;可下调K562细胞线粒体△ψm,有38.33%的细胞出现线粒体△ψm下降;可增强CytC的表达,激光光度扫描仪测得其表达光密度值由2.33±0.3升高到4.78±0.1。结论:线粒体途径通过介导凋亡信号而在CML信号转导中发挥重要作用。 相似文献
13.
siRNA诱导K562细胞凋亡的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建抗bcr/ablmRNA的小干扰RNA(smallinterferenceRNA ,siRNA)表达载体 ,转染K5 6 2细胞 ,检测诱导细胞凋亡的变化。方法参照siRNA模板设计原则 ,设计并合成两条siRNA模板序列 ,将其插入质粒pSilencer1.0 U6中得到重组子pBCR6 ,通过限制性酶切和测序鉴定 ,大量制备、纯化 ;以X tremeGENEQ2介导瞬时转染K5 6 2细胞 ,设置空载体作为对照。在转染后不同时间 ,利用原位缺口末端标记法 (TUNEL)、膜联蛋白Ⅴ 碘化丙锭染色法 (AnnexinⅤ /PI)通过流式细胞仪检测K5 6 2细胞凋亡的变化。结果针对bcr/ablmRNA融合区域设计的siRNA模板序列 ,经筛选合成寡核苷酸链后退火形成双链 ,再插入pSilencer1.0 U6 ,经酶切和测序鉴定提示构建成功 ;大量制备、纯化后进行转染 ,在转染后 4 8,72hTUNEL法检测和AnnexinⅤ /PI染色法均显示抗bcr/ablmRNA的siRNA表达载体可有效诱导K5 6 2细胞凋亡 ,且随转染时间的延长凋亡率增高 [转染pBCR6 72h的K5 6 2细胞凋亡率为 (47.80± 1.6 3) % ],与对照组 [(6 .6 7± 0 .37) % ]比较差异有显著性 (P <0 .0 0 0 1)。结论抗bcr/ablmRNA的siRNA表达载体构建成功 ,初步结果显示它可以有效地诱导K5 6 2细胞发生凋亡 ,预期siRNA有望成为慢性髓系白血病分子靶向治疗的一个新工具。 相似文献
14.
慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为:位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tet-off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系,为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2-P210,同时将Tet-off质粒转染293细胞并筛选出单克隆,然后进一步转染pTRE2hyg-LUC质粒,通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tet-off细胞,然后将重组质粒pT2-P210转染到293Tet-off细胞中。结果表明:筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293pT2-P210单克隆细胞。结论:本研究筛选的293pT2-P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tet-off诱导表达系统调控的细胞系,它们适用于bcr/abl融合基因功能及其信号调控机制的深入研究。 相似文献
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青黛复方对K562细胞bcr/abl及JWA基因表达的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
为了研究不同浓度青黛复方对K562细胞株增殖、凋亡及bcr/abl、JWA基因表达水平的影响,为临床治疗提供理论依据,以不同浓度药物(2.5、5、7.5、10和20 mg/ml)处理K562细胞24小时后,光学显微镜下观察形态学改变;采用半定量RT-PCR技术检测各组bcr/abl及JWA基因在mRNA水平表达的变化.结果发现,随药物作用浓度升高,K562细胞逐渐呈典型凋亡形态学改变;bcr/abl及JWA基因表达呈浓度依赖性下降.结论:青黛复方能部分抑制K562 bcr/abl及JWA基因的表达,其对CML的疗效可能是通过促进细胞凋亡而实现的. 相似文献
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高三尖杉酯碱通过抑制P210^bcr/abl诱导K562细胞凋亡 总被引:5,自引:0,他引:5
为探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)抗慢性髓细胞白血病(CML)的机制,以CML细胞系K562细胞为对象,应用AnnexinV-PI双标志和Western印迹杂交技术,观察HHT对细胞凋亡和P210^bcr/abl癌蛋白的影响。结果表明,5-20ng/ml浓度的HHT可诱导K562细胞凋亡,但随着药物浓度的增加细胞出现坏死性死亡,HHT可使细胞内融合蛋白P210^bcr/abl的含量约减少70%,而对正常存在于细胞内的P145^c-abl无影响,上述结果证实,HHT通过对P210^bcr/abl的定向抑制作用促进CML细胞凋亡,这可能是其抗CML的分子机制。本研究为HHT在临床上的进一步应用提供了实验基础。 相似文献
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芒果甙诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡 总被引:12,自引:1,他引:12
本研究目的是探讨芒果甙对慢性髓系白血病细胞系K562细胞的作用及其作用机制。用噻唑蓝(MTT)法观察芒果甙时K562细胞生长的影响;应用细胞形态、DNA凝胶电泳和流式细胞术等观察芒果甙时K562细胞凋亡的诱导作用;用RT-PCR方法观察芒果甙作用K562细胞后ber/abl融合基因在转录水平的改变。结果发现。25—200μmol/L浓度的芒果甙均能显著抑制K562细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性。并能诱导K562细胞凋亡。随着药物作用浓度的增加,ber/abl融合基因的转录下调。结论:芒果甙可抑制K562细胞的增殖。并可能通过抑制bcr/abl融合基因的表达诱导K562细胞凋亡。 相似文献
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慢性髓系白血病细胞中SphK-1/S1P信号通路的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。为探讨SphK-1/S1P信号通路元件在CML细胞中的表达情况,研究P210^bcr/abl是否涉及到SphK-1/S1P信号通路,首先采用RT—PCR检测bcr/abl阳性的K562细胞和bcr/abl阳性的原代CML细胞中SphK-1和S1P受体mRNA的表达.进一步利用P210^bcr/abl特异抑制剂甲磺酸伊马替尼处理bcr/abl阳性的K562细胞和CML原代细胞,然后通过^32P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。结果表明:K562细胞经2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理0.5,2,6,24和48小时后,对SphK-1活性抑制强度分别为0.007%、38.9%、34.6%、28.1%和76.1%;CML原代细胞在使用2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理后SphK-1活性较对照下降(16.8—41.9)%。结论:CML细胞中存在SphK-1和S1P的表达,P210^bcr/abl具有激活SphK-1的作用。 相似文献