幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白与麦芽糖结合蛋白融合表达产物rMBP-NAP的分离纯化

目的：从E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)细菌中分离纯化与麦芽糖结合蛋白融合表达的重组幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白rMBP-NAP,筛选幽门螺杆菌口服疫苗抗原组分。方法：0．3mmol／L IPTG在37℃,230r／min条件下诱导基因丁程菌E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)3h。4℃ 4000g离心20min收获细胞。过柱缓冲液重悬细胞,一20℃冻仔过夜,在冰水浴中超卢破碎工程菌,4℃,9000g离心30min,十二烷基磺酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析工程菌中rMBP-NAP可溶性;低相对分子质量蛋白Marker做标准对照,GeneTool测定诱导蛋白相对分子质量。FPLC分子排阻层析法分离rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描法测纯化蛋白质的纯度,Bradford法检测蛋白质含量。结果：E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)诱导表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,占上清中蛋白总量的39．35％,相对分子质量约为57000,与预期结果一致;分子大小排阻层析一步法纯化rMBP-NAP纯度可达91％,含量可达0.121g/L。结论：FPLC分子排阻层析可从大肠丁程菌超声菌液巾快速纯化rMBP-NAP。     

人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人成熟转化生长因子β1（hmTGF-β1）的原核表达载体,表达并纯化hmTGF-β1蛋白。方法应用RT-PCR方法获得hmTGF-β1基因,连接至自带6His标签表达载体pET23b,构建原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,诱导表达hmTGF-β1融合蛋白,镍亲合层析法纯化融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析。结果成功构建了hmTGF-β1原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析,在约15kD处出现了一条新的蛋白条带,WesternBlot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合。应用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,分析纯度达95%。结论成功构建了hmTGF-β1蛋白的原核表达质粒,并成功表达与纯化hmTGF-β1蛋白,为进一步复性、获得有活性的hmTGF-β1打下基础。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

目的 构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1α PAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLyss内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(NiNTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白.结论 含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础.     

幽门螺杆菌Omp22-HpaA融合基因工程菌蛋白的表达

目的:优化幽门螺杆菌Omp22-HpaA基因工程菌pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达条件,并对其表达产物进行纯化和鉴定.方法:在不同诱导时机、不同诱导剂(IPTG)浓度和不同诱导时间条件下诱导pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,采用Amyloss树脂预装柱对可溶性Omp22-HpaA蛋白进行分离、纯化,对纯化后的蛋白行Western blot分析.结果:工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.4 mmol/L)诱导7 h,目的蛋白Omp22-HpaA表达量达到菌体总蛋白的20%以上.经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性.结论:建立了从pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1可溶性表达产物中纯化较高纯度Omp22-HpaA融合蛋白的方法.     

α-OGG1与ACO2蛋白的表达纯化及其相互作用鉴定

[目的]原核表达纯化获得可溶性α-OGG1,ACO2蛋白并初步鉴定其相互作用.[方法]将α-OGG1,ACO2基因构建到pGEX-4T-2-TEV和pET-28a-TEV表达载体上,转化至BL21(DE3)大肠杆菌.IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni柱和GST柱亲和层析法纯化目标融合蛋白;采用SDS-PAGE检测表达产物;采用GST-Pulldown方法鉴定蛋白与蛋白的相互作用;采用双质粒共转化,表达纯化α-OGG1,ACO2蛋白复合体.[结果]成功克隆并构建了α-OGG1及其N-半段、C-半段基因和ACO2基因的原核表达载体,并转化至大肠杆菌表达.通过Ni柱和GST柱亲和层析法得到可溶性表达的6×His_α-OGG1(1-326)和GST_ACO2(29-780)蛋白,SDS-PAGE检测结果表明2个蛋白条带均与理论大小相符.GSTPulldown实验结果证实α-OGG1与ACO2直接相互作用.通过共转化、表达纯化得到了α-OGG1与ACO2的复合物.[结论]采用原核表达和亲和层析纯化得到了可溶性6×His_α-OGG1,GST_ACO2融合蛋白及两者的复合体,并初步证实α-OGG1与ACO2存在直接相互作用.     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

组织因子单克隆抗体及对照抗体的制备、纯化和鉴定

目的纯化组织因子(TF)单克隆抗体及对照抗体。方法给小鼠腹腔注射杂交瘤8A3和9E10细胞,产生的腹水应用凝胶过滤层析法和Protein A亲和层析法纯化组织因子抗体及对照抗体,并用SDS-PAGE和BCA法检测纯化后单克隆抗体的纯度及蛋白浓度。结果单抗纯化后电泳重链和轻链都呈一条带,TF抗体和对照抗体的最终浓度分别为0.7726mg/ml和0.8592mg/ml。结论应用层析法和凝胶过滤和Protein A亲和分离层析法纯化抗体,能够得到纯度较高的单克隆抗体。     

JC病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 构建JC病毒衣壳蛋白VP1基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化该蛋白. 方法用PCR方法扩增患者尿液中JC病毒衣壳蛋白VP1的基因,测序正确后将其克隆入pET-32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达VP1融合蛋白.大量表达该融合蛋白并用镍柱亲和层析法纯化. 结果成功构建重组表达载体,30℃,IPTG诱导可见有融合蛋白表达,存在形式为包涵体.该融合蛋白相对分子质量约为59kDa.Western blot证明融合蛋白具有很好的抗原性.用镍柱亲和层析法成功纯化出VP1融合蛋白.结论 成功表达VP1融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。     

嗜酸乳杆菌ATCC4356 S-层蛋白的克隆、表达和纯化

目的 克隆嗜酸乳杆菌S层蛋白的编码基因,使其原核表达并纯化表达产物。方法 对嗜酸乳杆菌S层蛋白（S-layer protein）基因进行提取和扩增,连接pET-SUMO3表达载体并转入大肠杆菌内使其表达;采用镍柱亲和层析技术对S层蛋白进行提取及纯化,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blotting验证表达产物。结果 嗜酸乳杆菌ATCC4356的S层蛋白编码基因（1 263 bp）被克隆,且与相关基因有98%同源性。SDS-PAGE及Western blotting证明,重组融合蛋白在细菌中能够高效表达且部分融合蛋白可经亲和层析及酶切去除融合标签获得重组S-层蛋白（43 0000 Da）。结论 通过获得嗜酸乳杆菌S-层蛋白编码基因的方法可实现其原核表达,并得到纯度较高的S层蛋白,为后续的生物学功能研究奠定了基础。     

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.