BMP-4基因影响乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力涉及NF-κB途径

目的探讨骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein 4,BMP-4)基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响途径。方法通过向乳腺癌MCF-7细胞株转染PET-BMP-4质粒过表达BMP-4;采用RT-PCR、MTT法、Boyden小室培养、Hoechst染色、Western blot方法,检测质粒转染、NF-κB抑制剂吡咯二硫代氨基甲酸盐(pyrrodlidine dthiocarbamate,PDTC)预处理和对照组细胞增殖、凋亡、迁移能力及NF-κB、Bax、Bcl-2水平。结果与空质粒转染组和空白对照组细胞相比,过表达BMP-4基因可导致MCF-7细胞增殖能力升高,凋亡细胞比例降低,细胞迁移能力增强,NF-κB和Bcl-2表达水平升高,Bax表达水平降低(P<0.05);PDTC预处理后NF-κB和Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高,显著降低过表达BMP-4对MCF-7细胞的生物学效应(P<0.05)。结论过表达BMP-4基因可增强乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移能力并抑制其凋亡,可能与上调NF-κB有关。     

NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8 F细胞增殖

目的：探讨核因子-κB(NF-κB)沉默对鼻咽癌5-8F细胞的增殖抑制作用。方法构建NF-κB p65沉默重组质粒表达载体pGenesil-1.2-NF-κB和阴性对照重组质粒载体pGenesil-1.2-HK,应用转染试剂将重组质粒表达载体转染人鼻咽癌5-8F细胞,采用Western blot法检测NF-κB p65的表达,采用MTT及流式细胞仪分析细胞增殖和细胞周期。结果 NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖,抑制率为(58．43±1．24)%,与对照组细胞抑制率(0)和阴性对照组细胞抑制率(17．89±4．13)%比较,差异有统计学意义( P<0．05)。 NF-κB沉默组S期细胞为(42．27±0．39)%,与空白对照组(30．83±1．36)%和阴性对照组(34．88±0．85)%比较,差异有统计学意义( P<0．05)。结论 NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖,其可能是通过S期细胞阻滞起作用。     

RNAi沉默STAT3基因联合化疗对人喉鳞癌细胞增殖的影响

目的利用RNAi沉默STAT3基因联合化疗,探讨其对喉鳞癌细胞凋亡的影响。方法体外培养人喉鳞状细胞癌hep—2细胞株,重组质粒脂质体包裹转染Hep-2细胞,实验分为五组。MTT法检测不同实验组转染24h、48h及72h的细胞增殖情况。流式细胞技术检测不同实验组转染后的细胞周期变化情况,及不同实验组转染后p-STAT3及其靶基因产物CyclinD1的蛋白表达水平。结果 （1）STAT3-siRNA增强了DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用和对细胞周期的阻滞作用;（2）转染72h后,流式细胞仪检测结果显示,重组质粒转染＋化疗组的STAT3信号传导通路相关蛋白的表达受到明显的抑制。结论 RNAi沉默STAT3基因能够降低相关调控蛋白的表达,提高人喉鳞状细胞癌hep—2细胞株对化疗的敏感性。     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

NF-κB基因沉默对人胃癌SGC7901细胞增殖影响及机制探讨

目的:研究NF-κB基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖及TFF3、ERK表达的影响。方法:应用脂质体法将靶向NF-κB的干扰RNA(si RNA)转染入胃癌细胞株SGC7901中。采用MTT法和流式细胞术法检测NF-κB基因沉默对SGC7901细胞的增殖抑制率和细胞凋亡情况,运用Real time PCR和Western blot免疫蛋白印迹法检测SGC7901细胞内TFF3、ERK的表达。结果:MTT法显示NF-κB基因沉默组癌细胞抑制率大于空白载体组和对照组(P0.01);流式细胞术法表明NF-κB基因沉默组细胞凋亡比例达12.60%,明显高于空白载体组和对照组(P0.01);RT-PCR和Western Blot检测示,经NF-κB基因沉默后,细胞内NF-κB、TFF3、ERK m RNA及蛋白表达量下降明显。结论:NF-κB基因沉默可抑制胃癌细胞的增殖并促进其凋亡。NF-κB基因作为胃癌治疗的分子靶点可能具有重要意义。     

RNAi技术沉默Bmi-1基因对人胃癌AGS细胞株的作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bmi-1基因表达对人胃癌细胞株AGS增殖和侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL-GFP,构建针对Bmi-1基因shRNA序列的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1,转染AGS细胞,采用Western blot检测重组质粒对Bmi-1蛋白表达的影响,MTT法检测重组质粒对AGS细胞体外生长的抑制作用,PI单染法流式细胞术检测转染重组质粒后细胞凋亡与细胞周期的变化,小室侵袭实验检测AGS细胞侵袭能力变化。结果:成功构建了vshRNA-Bmi-1重组质粒,并成功转染AGS细胞抑制Bmi-1蛋白的表达。转染重组质粒后,AGS细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加,S期比例上升,细胞侵袭能力弱于非特异性转染组。结论:vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1蛋白在AGS胃癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭,促进其凋亡。     

肺岩宁方对肿瘤坏死因子α诱导的人肺癌细胞系核转录因子κB基因表达的影响

目的：探讨中药肺岩宁方含药血清对肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor—α,TNF—α）诱导的人肺癌细胞系A549核转录因子KB（nuclearfactor—κB,NF—κB）基因表达的影响。方法：制备肺岩宁方含药血清,以肺癌细胞系A549为靶细胞,确定肺岩宁方含药血清用药浓度。将A549细胞分为对照血清组、TNFα组、肺岩宁方含药血清组和综合治疗组。观察用药前后A549细胞大体形态变化;四唑单钠盐法测定肺岩宁方含药血清对细胞增殖的影响;蛋白印迹法检测肺岩宁方含药血清对TNF-α诱导的细胞核NF-κ及抑制性核转录因子（inhibitorxBa,IκBα）表达的影响;将人NF-κB重组质粒用脂质体转染法导入A549细胞24h后,用肺岩宁方含药血清治疗24h,采用双荧光素酶报告基因系统测定肺岩宁方含药血清对TNF—α诱导的细胞核NF-κBp65转录活性的影响。结果：与对照血清比较．15％和20％肺岩宁方含药血清对A549细胞具有明显的增殖抑制作用（P〈0．05,P〈0.01）。1μg／L TNF—α能够明显提高NF—κB基因的表达,与肺岩宁方含药血清共同作用后,能够显著抑制它的表达（P〈0．01）,而细胞内IκBα的表达差异无统计学意义（P〈0．05）;肺岩宁方含药血清能够显著降低A549细胞经NF—κB重组质粒转染后的转录活性（P〈0．01）。结论：肺岩宁方含药血清可抑制人肺癌细胞系增殖,可能是通过对TNF-α诱导的NF-κB基因活性的抑制作用实现的。。     

Ciglitazone在NF-κB圈套寡核苷酸抑制肝癌细胞增殖中的作用

目的:观察核转录因子-κB圈套寡核苷酸抑制NF-κB活性后,肝癌HepG2细胞对ciglitazone敏感性的变化。方法:运用基因转染技术将NF-κB圈套寡核苷酸转染入肝癌HepG2细胞中,检测转染前后NF-κB活性。再用ciglitazone处理转染细胞,描记HepG2细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测处理前后细胞周期素D1(Cyclin D1)的变化。结果:转染后的肝癌HepG2细胞NF-κB活性明显降低;ciglitazone抑制HepG2细胞增殖作用增强,70.65%的细胞被阻滞于G1/G0期,Cyclin D1表达明显下降。结论:NF-κB圈套寡核苷酸能增加肝癌HepG2细胞对ciglitazone的敏感性,可能与其下调NF-κB的活性、增强ciglitazone抑制肝癌细胞增殖和阻滞细胞周期有关。     

活化的Notch1下调NF-κB对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响

目的构建重组逆转录病毒表达载体pCLNRX—ICN,研究Notch1过度活化对人宫颈癌HeLa细胞生长的影响,并探讨其作用机制。方法通过逆转录病毒感染,将Notch1（ICN）基因导入并整合到HeLa细胞的基因组中。MTT法检测稳定表达ICN对HeLa细胞生长的影响,并将阳性克隆细胞皮下接种裸鼠,观察ICN基因转染前后细胞系在裸鼠体内的致瘤能力。流式细胞仪分析细胞凋亡的变化,Westem blot及EMSA检测转录因子NF—κB及相关基因的变化。结果成功建立了稳定表达ICN基因的宫颈癌细胞株HeLa-ICN。活化的Notch1显著抑制HeLa细胞体内外增殖能力。而且在诱导HeLa细胞发生凋亡的同时,活化的Notch1可上调HeLa细胞中IκBα的表达,并下调NF-κB活性及其调节基因Bcl-2、c-Myc和cyclin D1的表达。结论活化的Notch1可通过诱导细胞凋亡和下调NF—κB活性而抑制人宫颈癌细胞增殖。     

PDTC联合紫杉醇降低MDA-MB-231细胞增殖侵袭能力

目的探讨核因子-κB(NF-κB)抑制剂——吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)联合紫杉醇(Paclitaxel)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖侵袭能力的影响。方法MTT及FCM法测定细胞增殖和周期变化,RT-PCR检测细胞NF-κB p65 mRNA的变化,Western blot检测细胞NF-κB p65、MMP-9及TIMP-1蛋白表达变化,侵袭、迁移和黏附实验测定细胞侵袭转移能力的改变。结果PDTC联合紫杉醇能明显抑制肿瘤细胞生长(P<0.05),细胞周期阻滞在G1/G0期,并可抵消紫杉醇对NF-κB的激活,使NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05)。PDTC降低MDA-MB-231细胞的侵袭转移能力,与紫杉醇联合应用后作用增强(P<0.01)。结论PDTC联合紫杉醇能降低乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭转移能力,其机制可能与PDTC抑制NF-κB的表达相关。     

RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

目的研究针对分化抑制因子-1的siRNA（si-Id-1）对人食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞增殖和凋亡影响的可能机制。方法阳离子脂质体法介导si-Id-1转染ESCC TE-1细胞株,倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化并计算转染率,RT-PCR检测Id-1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测Id-1的蛋白表达水平;细胞增殖实验检测转染前后TE-1细胞增殖能力变化;流式细胞术检测各组细胞的周期变化和凋亡指数。结果si-Id-1转染前后的TE-1细胞株Id-1的mRNA和蛋白表达水平有明显差异（P〈0.05）;转染后的TE-1细胞较其亲代细胞增殖能力降低,凋亡程度增强（P〈0.05）;转染后的TE-1细胞周期停滞在G0/G1期,G1期细胞数增多,S期细胞数减少（P〈0.05）。结论利用脂质体将si-Id-1转染至ESCC的TE-1细胞是切实可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1细胞Id-1的表达,从而抑制ESCC细胞增殖。     

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,

Abstract：

Objective To construct a eukaryotic fluorescent expression vector of truncated lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF-1) gene and investigate its effect on the proliferation and apoptosis of human colonic carcinoma cell line SW480. Methods Truncated LEF-1 gene was obtained by PCR and DNA recombination from human lymphoid node cDNA library. The PCR product of LEF-1 gene was inserted into the plasmid pMD-18T and sequenced. The truncated LEF-1 gene was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 and fused with mRFP for tracing. Using Lipofectamine~(TM) 2000, the plasmid pcDNA3.1 -LEF-1 -mRFP was transfected into Hela cells and detected by Western blotting and fluorescence activated cell sorting (FACS). The changes in the growth, proliferation and apoptosis of the SW480 cells were observed after transfection with the plasmids. Results The truncated LEF-1 gene was successfully cloned. After transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, the Hela cells expressed the product of LEF-1 as detected by Western blotting and FACS. The growth and proliferation of SW480 cells was inhibited and the cell apoptosis increased after transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, which also caused cell cycle arrest in G_(0/1) phase. Conclusion The eukaryotic expression fluorescent vector pcDNA3.1-LEF-1-mRFP has been constructed and expressed in eukaryotic cell line successfully. The truncated LEF-1 protein expressed in the transfected SW480 cells results in inhibition of the cell growth and proliferation with increased cell apoptosis and cell cycle arrest in G_(0/1) phase.     

PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究

目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

芦荟大黄素调控Notch-1/Akt/NF-κB信号通路对胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响

目的:观察芦荟大黄素调控Notch-1/AKT/NF-κB信号通路对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。方法:实验分为对照组(正常培养SGC-7901细胞)、芦荟大黄素低剂量组(SGC-7901细胞+芦荟大黄素10 mg·L^-1)、芦荟大黄素中剂量组(SGC-7901细胞+芦荟大黄素30 mg·L^-1)及芦荟大黄素高剂量组(SGC-7901细胞+芦荟大黄素50 mg·L^-1)。噻唑蓝比色法检测各组细胞培养后的增殖抑制率;Transwell小室检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞周期分布;Annexin V-APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡情况;Western blot法检测Notch-1/AKT/NF-κB信号通路蛋白及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达。结果:与对照组比较,芦荟大黄素低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞增殖抑制率升高(P<0.05),细胞穿膜个数和划痕闭合率明显降低(P<0.05),G0/G1期肿瘤细胞比例增加(P<0.05),细胞凋亡AI值升高(P<0.05),Notch-1、p-Akt、P65、Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值降低,Bax表达升高(P<0.05)。结论:芦荟大黄素可能通过阻滞SGC-7901细胞在G0/G1期,抑制其增殖能力,降低迁移和侵袭能力,并通过抑制Notch-1/AKT/NF-κB信号通路起到诱导细胞凋亡作用。     

NF-κB信号通路阻断对肝癌细胞SMMC7721增殖的影响

目的研究NF-κB信号通路阻断对肝癌细胞SMMC7721生长增殖的影响。方法常规培养SMMC7721细胞,采用SN50（36μmol/L）阻断NF-κB信号通路,Western blot检测核内p65蛋白水平,MTT比色法检测细胞生长增殖,计算肿瘤细胞生长抑制率,PI染色、流式细胞仪分析细胞周期与凋亡,观察NF-κB信号通路阻断对肝癌细胞SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。结果肝细胞癌SMMC7721细胞核内存在较高水平的p65蛋白。经SN50阻断后,MTT测定显示细胞的增殖受到明显抑制,并随时间的延长而愈渐明显,24、48、72h后细胞增殖抑制率分别为22.77%、33.33%和38.89%,与阻断前相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。流式细胞仪检测发现实验组G1期细胞比例高于对照组差异有统计学意义（69.5% vs 56.5%,P〈0.05）,S期细胞比例明显降低,与阻断前相比差异有统计学意义（11.1% vs 28.6%,P〈0.05）,而细胞凋亡率在实验组为38.3%,对照组仅为23.2%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论NF-κB信号通路阻断诱导细胞周期于G1期停滞和细胞凋亡,从而抑制了SMMC7721细胞生长与增殖,提示NF-κB信号通路组成性激活参与了肝细胞癌的生长增殖与发展,以NF-κB信号通路作为治疗的靶点可能给肝细胞癌带来新的治疗选择。     

奥沙利铂抗人肝癌细胞株QGY增殖及其机制的研究

目的观察抗肿瘤药物奥沙利铂对人肝癌细胞株QGY体外增殖的影响并探讨其机制,为其能否应用于肝癌的临床治疗提供理论依据.方法采用人肝癌细胞株QGY作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的奥沙利铂对细胞增殖的抑制效应;光镜及透射电镜观察细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白的表达.结果奥沙利铂对QGY细胞的增殖均有抑制作用而且呈时间和剂量依赖性.光镜观察发现细胞体积缩小,变圆,胞浆浓缩,核固缩深染,呈现凋亡早期的形态学改变.电镜可见凋亡细胞及凋亡小体.流式细胞仪检测到细胞阻滞于细胞周期的S期和G2/M期,G0/G1期细胞减少及凋亡峰.奥沙利铂作用72 h后,免疫细胞化学表明cyclin A、Bax表达增强,突变型P53蛋白(MTP53)、Bcl-2、Myc表达减弱,Fas表达无差异.结论奥沙利铂对QGY肝癌细胞的增殖都有一定的抑制作用,阻滞细胞周期于S期及G2/M期,它通过上调Bax的表达,下调MTP53、Bcl-2、Myc的表达而诱导细胞凋亡,该药可能不是通过Fas途径诱导细胞凋亡.     

慢性肾功能衰竭血清对兔主动脉内皮细胞增殖、凋亡及核因子κB信号通路活化的作用

目的 探讨慢性肾功能衰竭(CRF)血清对兔主动脉内皮细胞(AEC)增殖、凋亡和核因子κB信号通路活化及其下游炎症因子表达的影响.方法 建立CRF兔模型,采集其血清;不同浓度的CRF血清刺激原代培养的兔AEC后,四甲基偶氮噻唑盐检测细胞增殖,Hoechst33342染色观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法分别检测核因子κB、IκB mRNA及蛋白和肿瘤坏死因子(TNF)α蛋白表达;免疫荧光观察核因子κB P65核转位、电泳迁移率变异试验(EMSA)检测核因子κB DNA结合活性;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中TNF-α和白细胞介素(IL)6浓度.结果 (1)在较低浓度(≤10%)时,CRF血清对AEC的增殖有明显的促进作用,但血清浓度继续增加后,对AEC的增殖作用却明显减弱,促凋亡作用却增强,与对照组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.01).(2)10%CRF血清刺激后,与对照组相比,核因子κB mRNA(0.35:±0.05比0.26±0.02)及蛋白(1.67±0.15比0.41±0.05)表达均高;IκB mRNA(0.13±0.03比0.24±0.04)和蛋白(0.29±0.06比0.65±0.08)表达均低;核因子κB P65发生核转位;核因子κB DNA结合活性高(均P＜0.01).与对照组相比,10%CRF血清刺激后AEC分泌TNF-α和IL-6高,细胞中TNF-α蛋白表达高(0.37±0.04比0.14±0.03)(均P＜0.01).结论 CRF血清可导致AEC活化,低浓度导致AEC增殖,高浓度导致细胞凋亡;促增殖作用可能与其活化了核因子κB信号通路有关.这为进一步采取措施,防治CRF加速性动脉粥样硬化提供了一定的理论和实验依据.