色素上皮衍生因子在人白内障房水及晶状体上皮细胞中的表达

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)在人白内障眼房水及晶状体上皮细胞(LEC)中的表达水平与年龄的关系.方法 收集老年性白内障130例和先天性白内障15例.超声乳化术中取房水,酶联免疫吸附法(ELISA)检测房水PEDF浓度;选上述先天性白内障和老年性白内障高龄者各15例,术中取前囊膜标本用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测LEC的PEDF表达.结果 患眼房水PEDF平均浓度为(180.9±78.6)ng/ml,且与年龄均呈负相关(r=0.821,P＜0.001);患眼LEC中存在PEDF的蛋白表达,且幼龄组的表达水平远高于高龄组.结论 患眼LEC中存在PEDF活性,其房水及LEC中的PEDF水平均随年龄增加而显著下降,提示PEDF可能以旁分泌和自分泌的方式调节或(和)保护LEC.     

兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究

目的：在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法：采用酶辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲、透明质酸酶、重组人成纤维细胞生长因子-4及L-抗坏血酸-2-磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜、电镜观察和免疫组化染色鉴定.结果：成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论：酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶、苯硫脲、L-抗坏血酸-2-磷酸、重组人成纤维细胞生长因子-4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节.     

PEDF对低氧状态下人支气管上皮细胞表达VEGF的影响

目的:研究色素上皮衍生因子(PEDF)对低氧状态下人支气管上皮细胞(HBE)分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响,并探讨该作用与缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的相关性?方法:体外培养的HBE细胞取第3~7代用于实验,氯化钴(CoCl2)100 ?滋mol/L模拟缺氧状态?实验分为4组:正常对照组(A组)?氯化钴干预组(B组)?氯化钴 + PEDF 50 ng/ml干预组(C组)及氯化钴 + PEDF 200 ng/ml干预组(D组)?RT-PCR法检测各组细胞HIF-1α及VEGF 在mRNA水平上的表达差异;ELISA及Western blot法检测各组细胞VEGF蛋白表达水平;细胞免疫荧光染色法(IF)检测各组细胞HIF-1α蛋白在细胞质和细胞核中的表达情况?结果:①B组VEGF的mRNA水平较A组显著升高[为A组的(8.56 ± 0.67)倍,P < 0.01],C组与D组的VEGF mRNA水平较B组明显下降(P < 0.01);B组 HIF-1α mRNA的表达水平较A组明显升高(P < 0.01),B?C?D 3组间HIF-1α mRNA无统计学差异;②细胞培养基上清中B组VEGF表达量[(1 370.10 ± 42.98)pg/ml]较A组[(670.00 ± 23.35) pg/ml]明显升高(P < 0.01),且B组与C组[(816.19 ± 37.05) pg/ml]及D组[(646.47 ± 22.70)pg/ml]比较差异有统计学意义(P < 0.01)?③Western blot结果显示B组VEGF的蛋白表达量为A组的(3.99 ± 0.37)倍,差异有统计学意义(P < 0.01);C组与D组VEGF的蛋白表达水平较B组明显下降,差异有统计学意义(P < 0.05)?④IF结果显示,B组HIF-1α的表达水平及核内转移较A组和D组明显升高?结论:PEDF对低氧状态下HBE细胞高表达的VEGF具有一定抑制作用,且该抑制作用可能与PEDF调控HIF-1α有关?     

去整合素抑制体外培养的人眼晶状体上皮细胞生长的研究

目的:研究去整合素Kistrin对体外培养的人眼晶状体上皮细胞(HLECs)生长的抑制作用.方法:MTT法检测不同浓度去整合素Kistrin(5、10、20、40、80 μg/L)对HLECs的黏附抑制作用;划线法检测80μg/L的去整合素Kistrin对HLECs作用不同时间后(24、48、72 h)对其移行的抑制作用;MTT法检测不同浓度去整合素Kistrin(20、40、80 μg/L)对HLECs增殖的抑制作用.结果:不同浓度的去整合素Kistrin(20、40、80 μg/L)对HLECs的黏附和增殖具有抑制作用.80 μg/L的去整合素Kistrin可显著抑制HLECs的移行.结论:去整合素Kistrin对体外培养的HLECs的生长具有抑制作用.     

PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响

目的探讨PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响。方法采用不同浓度PP242处理培养传代的永生系人晶状体上皮细胞系SRA01/04。采用MTT法检测处理24、48 h后的细胞生长抑制率,采用实时定量RT-PCR和免疫印迹法检测不同浓度PP242处理48 h后Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平的变化情况。结果 100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞SRA01/04作用24、48 h后,细胞生长抑制率24 h组分别为7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%,48 h组分别为11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%,与对照组(0 nmol/L)比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。免疫印迹法检测结果显示:在相同作用时间内,随着PP242药物浓度的增加,Bcl-2蛋白的表达水平逐步下降,与对照组(0 nmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实时定量RT-PCR检测结果显示:在相同作用时间内,随着PP242药物浓度的增加,Bcl-2 mRNA表达水平亦逐步下降;m RNA相对表达量分别为0.723±0.039,0.517±0.028,0.353±0.052,0.167±0.046,与对照组(0 nmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PP242能够抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的生长,呈浓度和时间依赖性。人晶状体上皮细胞中存在Bcl-2的表达,PP242可下调其表达。     

紫外光诱导晶状体上皮细胞凋亡的研究

目的：研究紫外光（ultraviolet UV)诱导的晶状体上皮细胞（lens epithelial cell LEC)凋亡特征,方法：100mw/m2紫外光照射Vistar大鼠双眼15min,照射后1,6,24小时剥取晶状体膜,DNA缺口末端原位标记法定量检测凋亡的晶状体上皮细胞并通过透射电镜观察其形态学改变,结果：DNA缺口末端原位标记法检测仅在照射后24小时组发生凋亡特染细胞,其百分比为14．3％,透射电镜下可见染色质边集浓缩现象,结果：紫外光照射可快速诱导晶状体上皮细胞凋亡。     

PEDF对人脐静脉内皮细胞和肺癌SK-MES-1细胞增殖的影响及作用机制

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对SK-MES-1细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响及可能的机制.方法 CCK-8法检测不同浓度PEDF在不同作用时间条件下对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度PEDF对此两种细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测PEDF对此两种细胞中血管内皮生长因子(VEGF)基因表达水平的影响.结果 CCK-8结果显示,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞具有增殖抑制作用,呈一定浓度和时间依赖性(P<0.05);流式细胞术结果表明,实验组细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05),高浓度用药组凋亡率高于低浓度用药组(P<0.05);qRT-PCR结果表明,与对照组相比,PEDF能抑制HUVECs和SK-MES-1细胞中VEGF mRNA水平的表达(P<0.05).结论 PEDF的抗肿瘤作用主要包括抑制肿瘤血管生成和直接作用于肿瘤细胞两方面,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响可能与降低VEGF表达水平有关.     

PCNA与TGF-β1在人胎儿晶状体上皮细胞的表达

目的：观察增殖细胞核抗原（PCNA）及转化生长因子β1（TGF－β1）在人胎儿晶状体上皮细胞的表达。方法：用SP免疫组织化学法对48例人胎儿不同龄晶状体上皮细胞进行PCNA,TGF－β1免疫细胞化学染色,结果：PCNA,TGF－β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达,免疫阳性细胞随着胎龄的增加而减少。PCNA阳性细胞核为桔黄色或棕黄色,TGF－β1阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状,经相关分析,TGF－β1与PCNA呈正相关。结论：PCNA,TGF－β1在人胎儿不同胎龄胎晶状体上皮细胞均有表达,TGF－β1促进晶状体上皮细胞的增殖。     

miR-146a-5p靶向调控Notch2促进人晶状体上皮细胞线粒体损伤诱导的细胞凋亡

目的 探讨miR-146a-5p在人晶状体上皮细胞线粒体损伤中的调控作用,以及miR-146a-5p靶向调控Notch2表达对细胞凋亡的影响。方法 采用实时定量PCR (qRT-PCR)检测miR-146a-5p在白内障患者晶状体上皮中的表达。将miR-146a-5p模拟物转染人晶状体上皮细胞系SRA01/04,流式细胞术检测细胞凋亡。Western blotting检测凋亡相关蛋白caspase 9和caspase 12、线粒体损伤相关蛋白基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9、细胞色素c的表达。qRT-PCR检测NDUFS8、COX5b和ATP5a1 mRNA的表达。免疫荧光检测活性氧（ROS）释放。荧光素酶报告基因实验检测miR-146a-5p和Notch2的3’非翻译区靶向结合。Western blotting检测Notch2下游蛋白。结果 miR-146a-5p增加了SRA01/04细胞ROS的产生,诱发凋亡。miR-146a-5p过表达通过激活caspase 9,阻断线粒体能量代谢,促进线粒体介导的细胞凋亡。Notch2被确认为miR-146a-5p的靶点。结论 miR-...     

紫外光诱导晶状体上皮细胞凋亡的研究

目的研究紫外光(ultraviolet UV)诱导的晶状体上皮细胞(lensepithelialcell LEC)凋亡特征。方法100mw/m     

胰岛素样生长因子-1对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法对永生化人晶状体上皮细胞系B-3(HLEB-3)进行培养及传代,应用不同浓度的IGF-1(5、10、20、30、40、50、60μg.L-1)作用于HLEB-3细胞,在不同时间点采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测IGF-1对HLEB-3细胞增殖的影响。采用蛋白质印迹(West-ern blotting)方法检测晶状体上皮α-肌动蛋白(α-actin)的表达。结果 IGF-1在5μg.L-1时就对HLEB-3细胞有明显的促增殖作用(P<0.05),且随着IGF-1浓度的升高,促增殖作用增加,即促增殖效应具有浓度依赖性;同时也可上调α-actin蛋白的表达,与对照组比较,各浓度组IGF-1均可显著促进α-actin蛋白表达上调(P<0.01),且随着IGF-1浓度的增加,α-actin蛋白含量逐渐升高。结论 IGF-1具有促进人晶状体上皮细胞增殖的作用,其作用强度呈浓度依赖性。     

腺相关病毒介导色素上皮衍生因子转染人虹膜色素上皮细胞的体外研究

目的探讨以腺相关病毒(AAV)为载体,对体外培养的人虹膜色素上皮(IPE)细胞进行色素上皮衍生因子(PEDF)转染,获得高效表达PEDF转基因细胞的可行性。方法构建携带PEDF基因的重组AAV载体AAV-PEDF,体外培养人IPE,用1×106pfu的AAV-PEDF按感染复数(MO I)为0、2、10和20分别感染体外培养的IPE细胞;荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况;流式细胞术检测细胞转染效率;RT-PCR和W estern b lotting法鉴定PEDF在IPE细胞中的表达。结果 AAV-PEDF转染后,IPE细胞生长正常,用荧光显微镜、RT-PCR和W estern b lotting均检测到PEDF表达。在MO I为20时,细胞感染阳性率达64.22%。结论 AAV-PEDF能有效地转染体外培养的IPE细胞并有效表达PEDF。     

色素上皮衍生因子抑制脉络膜新生血管的实验研究

目的：观察重组人色素上皮衍生因子（recombinant human Pigment Epithelium—Derired Factor．rhPEDF）对氩激光诱导的棕色挪威（brown Norway,BN）大鼠脉络膜新生血管的抑制作用。方法：对2组10只BN大鼠单眼行氩激光视网膜光凝,建立脉络膜新生血管模型。光凝后1周,一组动物玻璃体内注射2ug rhPEDF／10uL PBS;另一组动物玻璃体内注射10uL的PBS作为对照组。光凝后2周,对2组动物进行眼底荧光血管造影（fundus fluorescence vascular imaging,FFA）、组织病理学检查及光镜下测量脉络膜新生血管（choroidal neovasculanzation,CNV）厚度并对FFA结果及CNV厚度进行图像及统计学分析,以评估rhPEDF对脉络膜新生血管的抑制效果。结果：视网膜光凝后2周,FFA检查对照组与rhPEDF组相比,荧光素渗漏明显增加,差异有统计学意义（P〈0．05）;CNV厚度检测结果,rhPEDF组光凝区CNV厚度低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：对氩激光诱导形成CNV的BN大鼠玻璃体腔内注射rhPEDF,可以抑制CNV的增殖。     

人类晶体上皮细胞的体外培养与观察

目的：建立人类晶体上皮细胞培养的简便方法并观察原代和传代细胞的生物学特征和组织学变化。方法：将人工晶体植入术中取下的前囊膜分割成小碎片，吸管转移至培养瓶底部进行原代培养，7—10d后常规方法进行传代培养，采用相差显微镜观察活体细胞的增殖活动和形态学变化。结果：人类晶体上皮细胞在体外培养时可以存活并传代，但是其生存能力与供体年龄有关。传代后期细胞发生纤维化改变。结论：本方法简便，有效。可用于实验研究。     

Caspase-3及Bax在人晶状体上皮细胞中的表达

目的 :观察Caspase 3及Bax在人晶状体上皮细胞中的表达 .方法 :收集 30只白内障晶状体前囊膜以及胚胎晶状体 (6只 )和成人透明晶状体 (4只 )的前囊膜 ,采用免疫组织化学的方法观察Caspase 3及Bax的表达情况及染色强度 .结果 :Caspase 3及Bax在各型白内障中均有很好的表达 ,在年龄相关性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 11/ 12 ,10 / 12 ,在高度近视性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 7/ 8,6 / 8,在外伤性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 5 / 6 ,5 / 6 ,在并发性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 3/ 4 ,4 / 4 ;在各型白内障中Caspase 3及Bax的表达没有显著性差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :在白内障的发生中存在晶体上皮细胞的凋亡     

碱性成纤维细胞生长因子促体外培养人晶状体上皮细胞株增殖及细胞周期的研究

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）与体外培养的人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）株增殖之间的关系及其对细胞周期的影响.方法 对人晶状体上皮细胞株（SRA01/04）进行无血清培养液培养,取对数生长期细胞进行实验,分别加入不同终浓度的bFGF （0.01、0.10、1.00、10.00及100.00μg/ L） ）共同培养24、48、72 h后MTT法测定细胞增殖情况,以流式细胞仪分析bFGF对细胞增殖周期的影响.结果 bFGF浓度为0.1μg/L、1.00μg/ L、10.0μg/ L、100.00μg/ L时,对HLEC细胞有明显的促增殖作用,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）;100.00μg/ L作用24h増殖率最大112.78%,作用强度呈浓度时间依赖性; bFGF促进HLEC细胞周期发生变化,S期和G2/M期细胞比例增加,G0/G1期细胞减少,说明bFGF通过促进HLEC细胞越过G1期限止点进入增殖状态.结论 bFGF可促进HLEC的增殖,改变细胞周期,是HLECs强有力的促增殖因子.     

微波辐射后晶状体上皮细胞与未辐射晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱比较

[目的]比较正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱差异,从蛋白质组水平初步探索微波辐射对人眼晶状体的损伤。[方法]体外培养人晶状体上皮细胞株,随机分为实验组和对照组,实验组用SAR值为4.0 W/kg的1800 MHz制式微波辐照2 h,对照组同一辐射箱培养但不辐射。辐照后立即提取总蛋白质,固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳进行蛋白质分离,银染显色的凝胶通过GS-800扫描仪获取图像,使用PDQuest专业图像分析软件分析电泳图像。[结果]正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞分别检出897个和981个蛋白质斑点。对2张电泳图进行匹配后,发现有4个蛋白质点在辐射后细胞蛋白质组图谱中上调表达,3个蛋白质点下调表达。[结论]初步建立了人晶状体上皮细胞比较蛋白质组学的实验方法;差异蛋白质的发现为深入理解辐射性白内障发病机制提供了有益的线索。     

Effects of rapamycin on expression of Bcl-2 and Bax in human lens epithelial cells and cell cycle in rats

The effects of rapamycin on the expression of Bcl-2 and Bax protein in in vitro cultured human lens epithelial cells(LECs) and cell cycle were investigated in order to provide the theoretical basis for the development of new inhibitory drugs for clinical prevention and treatment of after-cataract.The cultured LECs of second and third passages were collected and treated with rapamycin.The LECs were transferred into 96-well culture plates and divided into 6 groups,and each group was set to have 8 duplicate wells.In the negative control group,the LECs were given culture medium only,and in the blank control group,only culture medium was given.In the four rapamycin-treated groups,different concentrations(20,40,60 and 80 ng/mL) of rapamycin were given.After treatment for 24,48 and 72 h,the absorbance(A) values in each well were determined by MTT assay.The cell cycles of all groups were detected by using flow cytometry.Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RFQ-PCR) and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax respectively.MTT assay showed that rapamycin could inhibit proliferation of LECs in a time-and dose-dependent manner.Flow cytometry revealed that rapamycin could block the conversion of LECs from G1 phase to S phase,resulting in the increase of cells in G1 phase and the decrease of the cells in S phase.RFQ-PCR indicated that rapamycin could down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA,but up-regulate the expression of Bax mRNA,suggesting it could induce apoptosis of LECs.Western blot demonstrated that rapamycin could suppress the expression of Bcl-2 protein,but promote the expression of Bax protein.It is concluded that rapamycin could inhibit proliferation of LECs probably not only by blocking the progression of cell cycle,but also by promoting the induction of apoptosis.     

LPS和PMA对人眼晶状体上皮细胞增殖和EGFR表达的影响

目的：观察人晶状体上皮(HLE)细胞表皮生长因子受体（EGFR）的表达，探讨脂多糖（LPS）和佛波醇酯（PMA）对HLE细胞增殖及EGFR表达的影响。方法：应用免疫组织化学方法检测年龄相关性白内障的HLE细胞组织及培养的胎儿HLE细胞EGFR蛋白表达,RT-PCR方法检测EGFR mRNA表达； 0.5、1.0、2.0 mg•L^-1的LPS及25、50、100 nmol•L^-1 PMA作用培养的HLE 细胞48 h后，MTT法检测细胞增殖率，RT-PC方法检测EGFR mRNA表达。结果：免疫组织化学和RT-PCR检测结果显示,年龄相关性白内障的HLE细胞及培养的胎儿HLE细胞中EGFR蛋白及mRNA呈阳性表达；0.5、1.0和2.0 mg•L^-1 LPS对HLE细胞的增殖率分别为（3.21±0.42）%、（12.25±1.34）%和（36.67±3.65）%，2.0 mg•L^-1LPS组与其他两组比较差异有显著性（F=7.709，P<0.01），并使EGFR mRNA表达增加；25、50和100 nmol•L^-1PMA各组组间比较，PMA对HLE细胞的增殖率差异无显著性（P>0.05），对EGFR mRNA表达无影响。结论:LPS通过促进EGFR表达使HLE细胞增殖从而促进后发性白内障（PCO）的发生。  